免疫防御酶类：海洋动物L-氨基酸氧化酶的研究进展

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,大连市海珍品疾病防控重点实验室，辽宁大连 116023；2.中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室, 水产品安全教育部重点实验室, 广东广州 510275)

摘要:L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，LAAO)是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黄素单核苷酸(FMN)为辅酶的黄素蛋白酶, 该酶具有明显的抑菌、抗病毒、杀灭寄生虫、诱导细胞凋亡和细胞毒性等生物学功能。LAAO在自然界分布广泛，以有关蛇毒源LAAO研究最为深入，但有关海洋动物LAAO的报道与研究尚处于起步阶段。本研究中对海洋动物LAAO的结构特征、相对分子质量、等电点、氧化催化特异性、热稳定性、组织分布、生物学功能和异源表达等方面进行综述，旨在为后续海洋动物LAAO的进一步研究提供参考。

关键词:L-氨基酸氧化酶(LAAO)；海洋动物；理化特性；生物学功能；组织分布；异源表达

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，LAAO)是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黄素单核苷酸(FMN)为辅酶的黄素蛋白酶,该酶能够立体特异性催化L-氨基酸氧化脱氨生成α-酮酸、氨和H2O2[1-2]。研究表明，LAAO具有抗病毒、抗细菌、抗真菌、杀寄生虫和抗肿瘤等生物学功能[3-8]。在自然界中LAAO分布广泛，细菌、真菌、藻类、蛇类、鱼类和哺乳动物类中均已有报道[5,9-12]，其中，对蛇毒源LAAO的研究最为深入。目前，已发现海洋动物LAAO具有抑制细菌的生长、杀灭病原寄生虫和诱导肿瘤细胞凋亡的生物学功能(表1)。Nagashima等[13]报道，从许氏平鮋Sebastes schlegeli 黏液中分离纯化出的LAAO，对杀鲑气单胞菌Aeromonas salraonicida、美人鱼发光杆菌Photobacterium damselae 和腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens 等革兰氏阴性细菌具有显著的抑制作用；Wang等[14]研究表明，从黄斑蓝子鱼Siganus oramin 血清中分离的LAAO对刺激隐核虫Cryptocaryon irritans、多子小瓜虫Ichthyophthirius multifiliis、布氏锥虫Trypanosoma brucei具有强烈的杀灭作用；Iijima等[15]报道，从截尾海兔Dolabella auricularia 蛋白腺分泌物中纯化到的LAAO可诱使小鼠淋巴瘤细胞EL-4凋亡，推测其具有抗肿瘤作用。本研究中，综述了目前有关海洋动物LAAO的研究进展，并对存在问题及后续研究进行了展望，旨在为海洋动物源LAAO的深入研究提供参考。

1 海洋动物LAAO的基本特征

LAAO多由两个非共价结合的亚基组成，亚基相对分子质量范围为52 000～85 000，如许氏平鮋黏液LAAO为同源二聚体结构，亚基相对分子质量为53 000[16]。对三聚体和四聚体结构的海洋动物LAAO也有报道，如黑斑海兔Aplysia kurodai 卵的匀浆液上清中分离出由3个不同亚基组成的LAAO，相对分子质量为250 000[17]；用蛋白质谱分析黄斑蓝子鱼LAAO的单体相对分子质量约为61 700，非变性凝胶电泳的结果显示其为同源四聚体结构[14]。研究表明，海洋动物LAAO具有3个结构域:FAD结合域、底物结合域和螺旋域[2,11-12]，从斑点海兔Aplysia punctata 墨汁、大西洋鳕鱼Gadus morhua黏液中分离的LAAO证实了其单体结构中具有辅酶FAD及FAD结合域[18-19]。海洋动物LAAO的相对分子质量范围在93 000～150 000[12]，关于其晶体结构的报道匮乏。目前的研究中海洋动物LAAO等电点在4.0～6.2之间[13-14,18-20]，偏酸性。

L-氨基酸氧化酶在自然界分布较为广泛，不同物种来源的LAAO催化底物范围具有差异，关于海洋动物LAAO的氧化催化活性机制有待进一步验证和深入研究。已有调查表明，海洋动物LAAO对氨基酸的氧化催化活性谱较窄，如从许氏平鮋黏液[13]和加州海兔Aplysia californica 墨汁[20]中分离出的LAAO只检测到对L-赖氨酸具有氧化催化活性；从斑点海兔墨汁中分离出的LAAO[19] 只对L-赖氨酸和L-精氨酸具有氧化催化特异性。

海洋动物LAAO能够在较广的温度范围内保持活性，当环境温度超过其阈值上升时，酶的活性随之下降。研究表明，斑点海兔LAAO保持活力稳定的温度范围为0～50 ℃，当温度升至60 ℃时，酶活性减少80%，温度达到70 ℃时该酶失去活性[19]。此外，部分海洋动物LAAO在室温下亦可保持较长时间的生物学活性。Yang等[20]从加州海兔墨汁中纯化出的LAAO室温存放5个月后依然保持其抑菌能力。

2 海洋动物LAAO的组织分布

海洋动物LAAO集中分布在生物体的皮肤、鳃、脾脏和肾脏中。Kitani等[18]利用RT-PCR技术在大西洋鳕鱼的皮肤、鳃、脾脏和头肾中检测到阳性信号，而在肌肉、胃、肠道和肝脏中未检测到LAAO的表达；此外，研究人员同样采用RT-PCR技术检测到迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda 感染大西洋鳕鱼后，皮肤LAAO基因的表达量提高2倍；鳗弧菌Vibrio anguillarum 感染鱼体后，鳃、脾脏和头肾中LAAO基因的表达量提高8倍[18,22]。

海洋动物的黏液在抵抗包括细菌在内的病原入侵过程中发挥了重要作用[22,30-31]，因此，从具有大量黏液的皮肤及鳃组织中分离并最终鉴定为LAAO的报道较多。Kitani等[32]利用LAAO特异性RNA探针进行原位杂交表明，LAAO分布于许氏平鮋表皮的基膜和鳃的上皮组织中；Kasai等[28]通过免疫组织化学在星斑川鲽Platichthys stellatus 的鳃组织中检测到LAAO的特异性表达。

脾脏及肾脏是硬骨鱼类的重要免疫器官[33-34]，在二者中均检测到海洋动物LAAO，这表明海洋动物LAAO与固有免疫应答相关[18,23,26]。

鱼类的血清同样含有抵抗病原入侵的抗菌物质[25,35-36],也被证明存在着LAAO，Wang等[23]在黄斑蓝子鱼血清中分离到一种具有抑菌能力的天然蛋白并鉴定为LAAO。此外，在海洋生物的卵巢及其他分泌物中也鉴定到LAAO的存在。2013年，Kitani等[32] 试验表明，LAAO在许氏平鮋的卵巢中也有微量表达；研究人员从海兔的墨汁、蛋白腺分泌液和卵匀浆液的上清中也可分离到具有生物学活性的LAAO[15,17,28-29]。

3 海洋动物LAAO的生物学功能

海洋动物LAAO对多种水产病原中常见的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均具有抑制作用。许氏平鮋黏液中的LAAO对杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种Photobacterium damselae subsp. piscicida、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila具有较强的抑菌作用，最小抑菌浓度(MIC)分别为0.078、0.16、0.63、0.31 μg/mL[16,24]。棘头床杜父鱼Myoxocephalus polyacanthocephalus 黏液中的LAAO具有较宽的抑菌谱，对杀鲑气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)可达到0.02 μg/mL[37-39]。

海洋动物LAAO的抑菌作用依赖于同细菌表面的结合，这可直接导致细菌表面出现褶皱及孔洞，形态发生显著变化。Kitani等[24]研究表明，许氏平鮋黏液中的LAAO可与美人鱼发光杆菌杀鱼亚种结合，而不与大肠杆菌Escherichia coli 结合，即大肠杆菌对LAAO表现出不敏感性。Wang等[23]报道，黄斑蓝子鱼血清中的LAAO可导致金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 表面出现褶皱，大肠杆菌表面出现明显的孔洞； Kitani等[24]研究表明，许氏平鮋黏液中的LAAO可导致杀鲑气单胞菌表面出现褶皱，副溶血性弧菌表面产生孔洞，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种菌体显著伸长。

海洋动物源LAAO的抑菌作用与H2O2的产生有关。许氏平鮋黏液中的LAAO与H2O2展现出相同的抑菌谱[24]，研究表明，过氧化氢酶可完全抑制许氏平鮋和棘头床杜父鱼黏液中LAAO的抑菌活性[1,6,21]。某些细菌可通过提高抗氧化酶的基因转录水平以抵抗H2O2造成的伤害。Kasai等[40] 发现，大肠杆菌对星斑川鲽LAAO不敏感，进一步研究发现，大肠杆菌编码谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的基因表达量显著增高，从而减少了活性氧对细菌的伤害。然而，也有研究指出海洋动物LAAO的抑菌作用不完全依赖于H2O2。Ko等[41]研究表明，加州海兔LAAO的抑菌活性需依赖于H2O2、α-酮酸及其他催化产物，因各组分同等浓度下单独作用时没有抑菌能力。

目前，关于海洋动物LAAO杀灭寄生虫的相关报道较少，其杀灭寄生虫的作用机制有待进一步研究，截至目前，仅报道过黄斑蓝子鱼LAAO具有杀灭寄生虫的生物学功能。研究表明，黄斑蓝子鱼血清中分离的LAAO可导致刺激隐核虫幼虫纤毛脱落、大核膨胀崩解、外膜破裂、内容物溢出[14,42-43]。此外，黄斑蓝子鱼的血清对布氏锥虫Trypanosoma brucei、多子小瓜虫Ichthyophthirius multifiliis 也具有强烈的杀灭作用，其中，对布氏锥虫的最小杀虫血清浓度为1.5%[23]。与此相似，研究较为深入的蛇毒源LAAO同样具有杀灭寄生虫的功能，如从蝮蛇Bothrops jararaca 毒液中分离到的LAAO对同属锥虫科Trypanosomatid 的利什曼原虫Leishmania amazonensis 具有杀灭作用[8]。

海洋动物源LAAO具有潜在的抗肿瘤生物学功能，它在体外可直接杀死肿瘤细胞及参与诱导肿瘤细胞的凋亡，甚至可以延长腹水中携带大量肿瘤细胞小鼠的生命。Butzke等[19]从斑点海兔墨汁中分离到的LAAO可在6～8 h内杀死肿瘤细胞Jurkat T；从黑斑海兔卵匀浆液上清中纯化得到的LAAO可在2～114 ng/mL的浓度下裂解杀死多种鼠源、人源肿瘤细胞，研究表明，对腹水中含有1×106 cells MM46肿瘤细胞的C3H/He小鼠腹腔注射LAAO后，小鼠生命得到显著延长，其中注射0.4、2单位LAAO的小鼠存活时间超过200 d[17,29]。Iijima等[15]研究显示，截尾海兔蛋白腺分泌物中的LAAO可诱导鼠T淋巴细胞瘤细胞EL-4的凋亡。研究人员发现，当异尖线虫Anisakis simplex 幼虫感染鲐鱼Chub mackerel 后，在感染部位形成的囊腔中纯化出的LAAO，以20 ng/mL的浓度与人早幼粒白血病细胞HL-60共孵育24 h可完全杀死肿瘤细胞，通过细胞核染色、流式细胞术等方法检测到了细胞凋亡的显著特征[27]。

海洋动物LAAO抗肿瘤的生物学活性与其催化产物H2O2有着较大的关系，高浓度的H2O2突破了肿瘤细胞抗氧化能力的极限，如斑点海兔墨汁中的LAAO通过特异性催化L-赖氨酸和L-精氨酸氧化脱氨产生H2O2，从而导致了 Jurkat T细胞的死亡[19]。进一步地研究表明，海洋动物LAAO具有不依赖于H2O2而诱导细胞凋亡的途径。当添加高剂量的H2O2酶时，截尾海兔墨汁中的LAAO对肿瘤细胞EL-4的毒性仅部分受到抑制，肿瘤细胞依然存在着凋亡的显著特征，如DNA的碎裂和Caspase 3活性的提高[15,44-45]。

4 海洋动物LAAO异源表达

LAAO具有多种生物学功能，具有广阔的应用前景，因此，针对该酶的异源表达研究一直是该领域的热点与难点。目前，已报道的海洋动物LAAO的异源表达可通过大肠杆菌和酵母表达系统实现，表达产物具有与野生型相近的生物学功能。Yang等[20]实现了加州海兔墨汁LAAO在大肠杆菌工程菌株的异源表达，重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，但其抑菌活性仅为野生型的1/3；Li等[46]选取毕赤酵母表达系统实现了黄斑蓝子鱼血清LAAO的异源表达，重组蛋白对多种革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌具有抑制作用，扫描电镜发现，细菌经重组蛋白处理后表面变得粗糙并有颗粒附着，细胞壁皱缩，细胞膜出现破裂。此外，重组蛋白的抑菌活性可受到H2O2酶的抑制，其广谱抗菌活性与过氧化氢有关；近期Kasai等[40]同样利用毕赤酵母表达系统重组表达了星斑川鲽黏液中的LAAO，重组蛋白可显著抑制葡萄球菌属Staphylococci 和耶尔森氏菌属Yersinia 细菌的生长，其中表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis 对重组蛋白最为敏感，其最小抑菌浓度(MIC)为0.078 μg/mL。此外，Li等[47]研究表明，经大肠杆菌重组表达的黄斑蓝子鱼血清中的LAAO，体外复性后可诱导刺激隐核虫幼虫裂解死亡，具有与野生型相近的杀灭寄生虫活性，但重组蛋白的活性较低。目前，关于海洋动物LAAO表达产物抗肿瘤的生物学活性还未见报道。

5 问题与展望

LAAO在自然界中分布广泛，作为蛇毒源的重要组成部分，研究多集中在蛇毒源LAAO的生物学活性尤其是抗肿瘤方面[48-50]。国内外对海洋动物LAAO的研究相对较少，为此仍需开展大量基础研究工作，比如更多的海洋动物LAAO分离及鉴定、晶体结构的掌握、更为具体的热稳定性研究，以及深入的氨基酸催化活性探究等。不同来源的海洋动物LAAO具有不同的生物学活性。研究表明，多数海洋动物黏液中的LAAO具有抑菌作用[18,28]，海兔墨汁中的LAAO具有抗肿瘤作用[19,20]，某些硬骨鱼类血清中的LAAO具有杀寄生虫的生物学功能[14]，为此，关于海洋动物LAAO组织分布与其生物学活性的关系需深入总结和探讨，推测LAAO在海洋动物的非特异性免疫中发挥了重要作用。海洋动物源LAAO具有广泛的生物学功能，这些功能目前多数被认为同蛇毒源LAAO类似，均在较大程度上依赖于氧化催化产物H2O2[2,12]，本研究中所提到的其他特殊作用机制仍有待揭示。

作为潜在的新型抗菌、杀寄生虫和抗肿瘤药物的研发对象，海洋动物LAAO的成功异源表达是其必须攻克的难关。目前，常用的表达系统主要包括原核表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和昆虫细胞杆状病毒表达系统[51]，其中原核表达系统虽然表达效率高、周期短，但表达产物经常发生错误的折叠并聚集成包涵体[52-53]；酵母表达系统能够进行特定的翻译后修饰但表达量较低[54]；截至目前，利用哺乳动物及昆虫细胞表达系统对海洋动物LAAO体外重组表达未见报道。因此，选用合适的表达系统开展海洋动物LAAO的异源表达并对表达产物的功能进行探究，必将是未来该领域研究的热点之一。

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L-amino acid oxidase as an enzyme related to innate immune defense in marine animals:research progress

(1.Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Valuable Sea Food Disease Prevention and Control in Dalian, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2.Key Laboratory for Aquatic Products Safety, Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol of Harmful Organisms and Resourse Utilization,Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

Abstract：L-amino acid oxidase (LAAO) as a family of flavoproteins protease containing coenzymes FAD or FMN has been reported to have significant biological functions including antiviral, antibacterial, antifungal, anti-parasitic and anti-tumor activities. So far, LAAO is widely found in nature and has been investigated intensively, especially snake venom LAAO. However, the LAAO isolated from marine animals was few reported. In this paper, structural features, molecular weight, pI value, catalytic specificity, storage stability, distribution, biological functions and heterologous expression of LAAO in marine animals are summarized to provide basic references for further study on LAAO in marine animals.

Key words：L-amino acid oxidase (LAAO); marine animal; physico-chemical property; biological function; tissue distribution; heterologous expression

基金项目：辽宁省教育厅一般项目(L2015077)；辽宁省博士科研启动基金资助项目(201601287)；大连海洋大学博士科研启动基金资助项目(HDYJ201617)

作者简介：侯玉林(1994—)，男，硕士研究生。E-mail:houyulin22@163.com

通信作者：黎睿君(1986—)，男，博士，讲师。E-mail:liruijun@dlou.edu.cn