摘要：为探究刺参Apostichopus japonicus对中草药的毒性反应,在水温13～15℃下采用水生生物急性毒性试验方法对体质量为(2.36±0.41)g的刺参幼参进行了5种中草药急性毒性试验。结果表明:单方中草药对刺参幼参的毒性大小依次为五倍子＞乌梅＞石榴皮＞黄芩＞甘草;五倍子、乌梅、石榴皮、黄芩和甘草对刺参幼参的48 h半致死浓度分别为0.340、2.027、2.149、2.234、4.900 g/L,安全浓度分别为0.055、0.272、0.166、0.271、0.605 g/L;6组复方药物中毒性最大的是五倍子+甘草,其次是五倍子+黄芩、甘草+黄芩、石榴皮+五倍子,乌梅+石榴皮、五倍子+乌梅两组复方的毒性最低。研究表明,在安全浓度范围内,单方中草药五倍子、乌梅,复方五倍子+乌梅、石榴皮+乌梅可用作刺参细菌性疾病的防治药物。
关键词：中草药;刺参;急性毒性;乌梅;五倍子;石榴皮;黄芩;甘草
刺参Apostichopus japonicus是中国北方沿海地区的重要经济养殖品种,2014年中国海参养殖面积达26.39万hm2,养殖产量达20.97万t(主要为刺参),产值超过200亿元[1],产生了巨大的经济效益和社会效益。但随着养殖规模的迅速扩张以及生产过程中的不规范操作,养殖刺参发生了多种疾病,其主要病因为细菌感染[2-8],表现为化皮、排脏等症状。目前,针对这些疾病的防治主要依赖于消毒剂和抗生素类药物,然而抗生素易产生残留,影响水产品质量安全,因此,研发绿色、无公害的防治药物具有重要的现实意义和广阔的发展前景。
中草药具有提高鱼类免疫力和促进生长的双重功效,且部分中草药本身具有抗菌能力,病原微生物一般不会对其产生抗药性[9]。因中草药具有天然性、毒副作用小、无残留、无抗药性[10]等优点,被视为抗生素的替代品,受到国内外科研工作者的重视。
关于中草药在刺参疾病防治中的研究报道较少。李华等[11]报道了几种中草药对海水养殖中常见病原菌的抗菌作用;王印庚等[5]开展了中草药对刺参腐皮综合征病原菌的体外抑菌试验;吴亚楠等[12]进行了复方中草药对刺参免疫力和抗病力影响的研究;丁鉴锋等[13]将复方中草药作为饲料添加剂,研究其对幼参的免疫机制。而有关刺参对中草药的毒性反应研究目前尚未见报道。
本试验中,通过前期体外抑菌试验,在筛选获得了具有明显抑菌作用的5种单方药和6种复方药的基础上,于13～15℃下进行了对刺参幼参的急性毒性试验,旨在探索刺参对中草药的毒性反应及其安全浓度,为中草药应用于刺参疾病防治提供参考依据。
1.1 材料
试验用中草药,均购于大连奇运生药店,经过实验室的前期体外抑菌杀菌试验[11],从10种中草药中筛选出具有较强杀菌能力的5种中草药分别为五倍子、石榴皮、黄芩、乌梅、甘草。
试验用刺参购于大连湾某海参养殖场,体长为3～5 cm,体质量为(2.36±0.41)g,在60 cm×30 cm×40 cm玻璃水族箱内暂养,养殖用水为大连市黑石礁海域沙滤海水,盐度为29～32,pH为7.9～8.3,水温为13～15℃。暂养期间不间断充氧,每日投饲、换水。
1.2 方法
1.2.1 中草药药液的煎制 将上述5种中草药各取(五倍子去虫尸)20 g分别加水200 mL,浸泡0.5 h后煎煮沸腾转文火煮0.5 h,过滤煎液,将药物残渣继续煎煮,共煎煮3次,合并滤液,浓缩至1 g/mL含药量,于冰箱(4℃)中保存(48 h内使用)。
1.2.2 单方药中草药对刺参的急性毒性试验
(1)10倍倍比稀释法。将上述药物用灭菌海水进行10倍倍比稀释(10 mg/L、100 mg/L、1 g/L、10 g/L、100 g/L),进行药物的急性毒性试验。每个药物浓度下取刺参3头,在2 L聚乙烯烧杯内浸浴给药24 h后,找出大致致死浓度范围,试验期间保持充氧,水温为13～15℃。
(2)2倍倍比稀释法。在2倍倍比稀释的中草药物各浓度(在步骤(1)中的大致范围内)下,取4头刺参,浸浴给药24 h后,记录死亡结果,试验条件同上,确定最高死亡率浓度LCmax和最低死亡率浓度LCmin。
(3)改良寇氏法。通过预试验确定正式试验时最高死亡率和最低死亡率的浓度范围,据此确定正式试验的具体分组试验方案,按照下式求算组间距(i值)为
根据预试验结果,石榴皮、乌梅、黄芩和甘草分别按等对数间距设置6个浓度组,五倍子设置10个浓度组,并设不添加中草药的对照组,每组设置2个平行,每组放养幼参10头,浸浴给药24、48、72 h时,观察并记录刺参的健康状况和死亡情况,采用“改良寇氏法”计算出48 h的半致死浓度LC50(g/L)和药物的安全浓度SC (g/L)[14-15],浓度设置见表3。
其中:Xm为最大浓度的常用对数;P为各组动物的死亡率,以小数表示;∑P为各组动物死亡率的总和;i为相邻两组浓度(LC)常用对数值之差(高浓度为分子),或相邻两组浓度之差。
1.2.3 复方药中草药对刺参的急性毒性试验 上述5种单方中草药经实验室前期体外联合药敏实验[11],筛选出6组抑菌杀菌效果较强的复方药物,分别为五倍子+乌梅、五倍子+黄芩、黄芩+甘草、石榴皮+乌梅、五倍子+石榴皮、五倍子+甘草。其中,每一组复方设置两个浓度组,每个浓度组设置两个平行,每组放养10头幼参,试验时间为48 h。浓度的设置为
2.1 单方中草药对刺参的急性毒性
2.1.1 10倍倍比稀释法 黄芩、乌梅、甘草、五倍子、石榴皮的10倍倍比稀释的药物浓度对刺参急性毒性预试验结果表明,五倍子的毒性较大,对刺参的致死浓度范围为0.1～1.0 g/L;黄芩、乌梅、石榴皮、甘草的毒性较小,对刺参的致死浓度范围为1～10 g/L(表1)。
表1 中草药对刺参的急性毒性预试验结果(10倍倍比稀释)
Tab.1 Toxicity of Chinese herbal medicines to sea cucumberApostichopus japonicusby 10 times'grade in a pretest
死亡数量浓度/(g·L-1) concentration试验刺参数量number of sea cucumber mortality in number黄芩Radix scutellariae乌梅Fructus mume甘草Glycyrrhiza uralensis fisch五倍子Galla chinensis石榴皮Pericarpium granat 0.01300000 0.10300000 1.00300030 10.00333333 i 100.00333333
2.1.2 2倍倍比稀释法 黄芩、乌梅、甘草、五倍子、石榴皮的2倍倍比稀释的药物浓度对刺参急性毒性预试验结果表明,五倍子对刺参的毒性较大,其对刺参的致死浓度范围为0.1～0.8 g/L,甘草的毒性最小,黄芩、乌梅、甘草、石榴皮,其对刺参的致死浓度范围为1～8 g/L(表2)。
表2 中草药对刺参的急性毒性预试验结果(2倍倍比稀释)
Tab.2 Toxicity of Chinese herbal medicines to sea cucumberApostichopus japonicusby double's grade in a pretest
死亡数量浓度/(g·L-1) concentration五倍子Galla chinensis 0.14——试验刺参数量number of sea cucumber mortality in number黄芩Radix scutellariae乌梅Fructus mume甘草Glycyrrhiza uralensis fisch石榴皮Pericarpium granati 0 0.24——1 0.44——3 0.84——4 1.040000—2.040403—4.044404—8.044444—
2.1.3 改良寇试法 单方中草药对刺参的急性毒性试验结果及48 h半致死浓度和安全浓度见表3,刺参表现出的毒性症状见图1。
黄芩:随着黄芩浓度的逐渐升高,其对刺参毒性逐渐变大,浓度大于等于2.40 g/L时,刺参72 h的死亡率达到100%。与其他中草药组相比,黄岑组体色接近于健康刺参的体色,而高浓度组部分刺参则出现背部疣足溃烂、局部化皮(图1-A)等症状。黄芩对刺参的48 h半致死浓度和安全浓度分别为2.234、0.271 g/L。
表3 中草药对刺参的急性毒性试验
Tab.3 Acute toxicity of Chinese herbal medicins to sea cucumberApostichopus japonicusin the experiment
药物medicine组间距i interval浓度/(g·L-1)死亡率48 h安全浓度/(g·L-1) concentration mortality/% 24 h48 h72 h 48 h半致死浓度/(g·L-1) 48 h LC5048 h SC黄芩Radix scutellariae 0.10 1.5001060 1.91105080 2.401060100 3.023080100 3.806090100 4.798090100 2.2340.271乌梅Fructus mume 0.13 0.7501010 1.0201040 1.38102060 1.861030100 2.513060100 3.395090100 2.0270.272甘草Glycyrrhiza uralensis fisch 0.08 3.5002040 4.1704070 5.011050100 6.031060100 7.245090100 9.108090100 4.9000.605五倍子Galla chinensis 0.094 0.10001010 0.12401010 0.154101020 0.191102040 0.238104040 0.295305050 0.366405060 0.4554070100 0.5654070100 0.7017080100 0.3400.055石榴皮Pericarpium granati 0.15 0.7501010 1.0103030 1.5103040 2.142050100 3.022060100 4.273080100 2.1490.166
乌梅:在施药后的前24 h,刺参表现出身体收缩,未见化皮症状。大部分刺参随时间的延长逐渐恢复,而高浓度组随作用时间的延长,个别刺参体壁呈现白色增生(图1-B),这些参48 h后死亡。乌梅对刺参的48 h半致死浓度和安全浓度分别为2.027、0.272 g/L。
甘草:刺参不适症状主要表现为化皮、萎缩、排脏,其中排脏现象严重,除3.50、4.17 g/L浓度组外,其他组刺参全部排脏(图1-C),死亡时最明显特征为身体透明化。甘草对刺参的48 h半致死浓度和安全浓度分别为4.900、0.605 g/L。
五倍子:各浓度组刺参均出现排便量增多的现象,濒死刺参体色微白、体壁变硬,未出现化皮、排脏症状(图1-D)。死亡刺参个体体色发白、背部疣足突出。五倍子对刺参的48 h半致死浓度和安全浓度分别为0.340、0.055 g/L。
石榴皮:试验组刺参体色较正常,极个别个体出现排脏现象,高浓度组个别刺参出现轻度化皮症状(图1-E)。石榴皮对刺参的48 h半致死浓度和安全浓度分别为2.149、0.166 g/L。
2.2 复方中草药对刺参的急性毒性
复方中草药对刺参的急性毒性试验结果表明:浓度1复方药物对刺参均未引起明显的变化,致死率均为0;浓度2复方药对刺参的急性毒性效果不同,五倍子+乌梅、乌梅+石榴皮复方组刺参体壁出现白色增生,五倍子+黄芩、石榴皮+五倍子的复方组刺参背部疣足突出且体壁变硬,甘草+黄芩、五倍子+甘草复方组刺参出现排脏和身体僵硬,而未出现化皮症状。本试验中刺参的死亡率表明,毒性最低的复方组为乌梅+石榴皮、五倍子+乌梅,致死率均为30%,其次为五倍子+黄芩、甘草+黄芩、石榴皮+五倍子,毒性最大组为五倍子+甘草,致死率达80%(表4)。
图1 刺参对不同中草药所表现出的毒性反应
Fig.1 The toxic reactions of sea cucumberApostichopus japonicusexposed to Chinese herbal medicines
注:A为黄芩药物组刺参背部疣足出现溃烂、局部出现化皮;B为乌梅药物组刺参体壁出现白色增生;C为甘草药物组刺参出现排脏; D为五倍子药物组刺参个体体色发白、背部疣足突出;E为石榴皮药物组刺参出现轻度化皮症状
Note:A,sea cucumber with skin ulcerate in notum parapodum and partitial autolysis in Radix scutellariae prescription;B,sea cucumber with white hyperplasia integument in Fructus mume prescription;C,sea cucumber with evisceration in Glycyrrhiza uralensis fisch prescription;D,sea cucumber with white body color and swollen notum parapodum in Galla chinensis prescription;E,sea cucumber with mild autolysis symptom in Pericarpium granati prescription
表4 复方中草药对刺参的急性毒性试验
Tab.4 Acute toxicity of complex prescription of Chinese herbal medicines to sea cucumberApostichopus japonicus
浓度concentration刺参数量number of sea cucumber mortality in number五倍子+乌梅五倍子+黄芩黄芩+甘草石榴皮+乌梅五倍子+石榴皮五倍子+死亡数量甘草浓度120000000浓度2206886816
3.1 单一中草药对刺参的毒性
5种中草药对刺参的急性毒性试验结果表明,单方中草药对刺参幼参的毒性大小依次为:五倍子＞乌梅＞石榴皮＞黄芩＞甘草。
五倍子对包括刺参病原在内的其他海水病原菌的抗菌效果最好[11],且作为外用中草药具有较好的创面修复功能[16],在水产养殖过程中被广泛使用[17]。然而在本试验中,五倍子则表现出对刺参的毒性最强,当高浓度时,其对刺参毒性主要是导致身体僵硬,可阻止刺参化皮症状的产生,这与五倍子有较强的收敛和凝固蛋白作用有关。有研究表明,五倍子主要成分为鞣质,含量达60%～80%,其能使皮肤、黏膜和溃疡的组织蛋白凝固,形成一层被膜,具有收敛、减少渗出作用[18-19]。当刺参受到感染或应激反应时,出现最多的症状则是化皮,因此,五倍子较好的抗菌功效和较强的收敛和凝固蛋白作用,正是预防和治疗刺参“化皮病”的理想药物,对其合理、谨慎配伍和使用非常重要。姚敬明等[20]等通过对小白鼠注射五倍子、石榴皮中提取的鞣质溶液进行毒性试验,结果显示,提取的这两种鞣质溶液均对小白鼠有毒性,且五倍子毒性要大于石榴皮,这与本试验结果基本一致。
乌梅具有收敛固涩、抗氧化等作用。有关乌梅对动物的毒性试验研究较少,而对人体的临床应用较多。王璐等[21]进行了乌梅及其炮制品对大鼠长期毒性试验,结果显示,乌梅及其炮制品对大鼠未出现毒性反应,血液等指标也未发现异常。但本试验研究发现,乌梅在高浓度下对刺参显示出一定的毒性作用,个别刺参体壁出现增生现象,这可能与不同物种有关。乌梅果实富含有机酸(如柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等)、萜类、甾醇、氨基酸、糖类、黄酮类、生物碱、微量元素(Fe、Mg、Cu等)[22]。乌梅的收敛作用,可导致刺参身体收缩,但并未出现化皮,其抗菌活性较强[11],可作为防治刺参细菌性疾病的理想药物。
石榴皮中含鞣质、石榴皮碱、异槲皮苷、树脂、甘露醇、没食子酸等,并含多种氨基酸和微量元素[23],低浓度石榴皮提取液对刺参未造成明显的生理变化,但浸浴在高浓度提取液时,刺参出现化皮的现象,这与郭新慧等[24]研究发现的石榴皮醇提物能够引起小鼠肝脏的急性损伤,且毒性随浓度增大而加强的结果相近。笔者认为,石榴皮虽含有具收敛作用的鞣质,但其含量相对五倍子较低,且石榴皮中含有较多其他成分,如石榴皮碱、异槲皮苷、没食子酸等,这可能是导致高浓度石榴皮提取液可造成刺参化皮的原因之一,在刺参养殖中应谨慎使用。
有研究表明,黄芩水煎液、醇提液对小鼠的毒性较低,具有较好的安全性,临床应用安全可靠[25]。本试验中,黄芩提取液对刺参的48 h半致死浓度为2.234 g/L,安全性也相对较好,但高浓度的黄芩提取液对刺参具有致死作用,且与五倍子和乌梅不同,刺参背部疣足出现溃烂,局部出现化皮症状,故在刺参疾病防治中不提倡单独使用黄芩。
本试验中,甘草对刺参48 h半致死浓度为4.900 g/L,毒性较小,与程艳芹等[26]发现甘草提取液对小鼠急性毒性甚小的结果一致。甘草有效成分主要为三萜皂苷类化合物等[27],一般认为,其对哺乳类动物的口服毒性很低,但对冷血动物具有一定毒性,本试验结果也显示,高浓度的甘草提取液能够导致刺参死亡。但试验中甘草在水体中存留时间过长时,会导致水体发臭,引起刺参化皮,导致大量排脏,故不建议在刺参疾病治疗中使用。
3.2 复方中草药对刺参的毒性
复方中草药对刺参的急性毒性试验结果表明:配伍后,除五倍子+甘草组毒性明显增强,其他配伍组如乌梅+石榴皮、五倍子+乌梅、五倍子+黄芩、甘草+黄芩、石榴皮+五倍子的毒性无显著性差异,配伍之后毒性均有所降低。
通过对复方甘草+五倍子与单方甘草、五倍子药效的比较发现,从刺参外观症状来看,复方组刺参未出现化皮症状,而单方甘草组刺参表现出化皮症状,分析原因是由于复方药物中五倍子含有的鞣质起到了收敛、减少渗出作用,阻止了刺参化皮;从刺参死亡情况分析,复方组在单方甘草、五倍子组的平均半致死浓度下对刺参造成的致死率达到80%,高于理论累加致死率50%,可能是由于五倍子和甘草配伍时产生了协同作用,使甘草中主要成分三萜皂苷类化合物的作用效果被增大,导致其对刺参的刺激增大,造成刺参排脏,故不提倡使用复方五倍子+甘草制剂。
复方乌梅+石榴皮、五倍子+乌梅、五倍子+黄芩、甘草+黄芩、石榴皮+五倍子在平均半致死浓度时对刺参造成的致死量均比理论累加致死量(死亡10头)低,其中复方乌梅+石榴皮、五倍子+乌梅组,配伍减毒效果最明显,致死率仅为30%,这可能是因配伍药物的有效成分互相结合产生拮抗作用,使其转化为毒性较低的物质,从而达到配伍减毒的结果。
综上所述,在安全浓度之下,单方中草药五倍子、乌梅,复方五倍子+乌梅、石榴皮+乌梅均可用于刺参细菌性疾病的防治。
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Acute toxicity of several Chinese herbal medicines to juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus
Abstract：Acute toxicity of 5 kinds of Chinese herbal medicines to juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus with body weight of(2.36±0.41)g was studied at water temperature of 13-15℃by an ordinary method to evaluate toxic effects of Chinese herbal medicine on sea cucumber.It was found that toxicity of single Chinese herbal medicine was descendantly arranged as Galla chinensis,Fructus mume,Pericarpium granati,Radix scutellariae and Glycyrrhiza uralensis fisch,with the 48 hours medial lethal concentration(LC50)of 0.340,2.027,2.149,2.234 and 4.900 g/L,and with safe concentration of 0.055,0.272,0.166,0.271,and 0.605 g/L,respectively.The maximal toxicity of 6 kinds of Chinese herbal medicine compounds was found in compound Galla chinensis+Glycyrrhiza uralensis fisch,followed by Galla chinensis+Radix scutellariae,Glycyrrhiza uralensis fisch+Radix scutellariae, and Pericarpium granati+Galla chinensis,and the minimal toxicity in two compound groups compound of Galla chinensis+Fructus mume,and compound of Fructus mume+Pericarpium granati.The findings suggested that Galla chinensis,Fructus mume and compound of Galla chinensis+Fructus mume,Fructus mume+Pericarpium granati,and be used in control and prevention of sea cucumber diseases.
Key words：Chinese herbal medicine;Apostichopus japonicus;acute toxicity;Fructus mume;Galla chinensis; Pericarpium granati;Radix scutellariae;Glycyrrhiza uralensis fisch
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.02.007
文章编号：2095-1388(2017)02-0161-06
中图分类号：S948;S91
文献标志码：:A
收稿日期：2016-12-22
基金项目：国家海洋公益行业专项(201405003);国家“星火计划”项目(2015GA650006);辽宁省海洋渔业厅重点攻关项目(201402)