施氏鲟抗热应激中草药免疫制剂的筛选

摘要：为筛选适用于鲟使用的抗热应激中草药免疫制剂,研究了中草药方剂对常温及高温应激情况下施氏鲟AcipenserschrenckiiBrandt免疫性能的影响。在22℃养殖水温下,将1+龄施氏鲟分为4个受试组,每组设两个平行,每个平行放30尾鲟,选取当归、鱼腥草和一种自组中草药复方(方四),分别以0.30、0.54、0.80 g/kg(体质量)的给药剂量对试验鲟口灌给药,每日1次,连续给药14 d,同时设立口灌蒸馏水的对照组;停药24 h后,每组取半数试验鲟于高温30℃下热刺激2 h后,与常温试验组共同采样,对试验鲟血清中蛋白含量、细胞吞噬和不同组织中溶菌酶活性进行测定。结果表明:方四和鱼腥草能有效抑制机体高温应激后血清中蛋白含量的异常增高;常温情况下,当归具有提高试验鲟细胞吞噬功能的作用;而方四不仅可以有效提高高温应激后机体的细胞吞噬作用,还可有效提高肝、血清、鳃和胃组织中的溶菌酶活性,并能在高温应激后保持其效果。研究表明,高温应激情况下,方四能有效保持施氏鲟机体内环境平衡,并促进机体细胞的吞噬作用和溶菌酶活性,可作为鲟抗热应激中草药免疫制剂进行深入研究。

作为变温低等脊椎动物的鱼类极易受水温变化的影响,喜低温的鱼类对高温尤其敏感[1]。温度作为控制因子,对鱼类代谢反应速率起着控制作用,并影响其生理生化进程[2]。有报道指出,鲟最高生存温度为30℃,水温高于28℃时其摄食与生长均会减缓或停止[3]。而施氏鲟Acipenser schrenckiiBrandt适宜生长水温为15～27℃[4],属亚冷性鱼类,高温会使其产生消化酶活性降低[5]、非特异性免疫受抑制[6]等负面作用,严重时甚至导致鲟大量死亡。

施氏鲟俗称七粒浮子,主要分布于中国黑龙江流域,具有个体大、生长快、成活率高、病害少、肉味鲜美和营养丰富等特点,并已开展海水驯养研究,是中国现存鲟鱼中最具经济价值的优质珍稀品种之一[7]。20世纪90年代,鲟养殖技术获得成功并迅速推广,1998—2002年鲟养殖量增加了50倍[8]。但由于养殖条件受限、环境污染,以及运输胁迫造成的高温应激等原因,经常会引起鱼类强应激反应,损害鱼体健康,甚至造成死亡,给鲟养殖业带来了极大的损失和困扰。

中草药不仅可单独或与其他药物联合使用以提高水产动物机体免疫力,还具有种类多、价格廉、副作用小、无残留等诸多优点,已成为替代抗生素、激素等化学药物的无公害免疫添加剂的研发热点。中国中草药品种居世界之首,多达5767种[9],现已发现200余种中草药具有良好的免疫活性,可影响和调节动物机体的免疫功能[10]。目前,有关中草药添加剂对畜[11-12]、禽[13-14]等抗热应激研究较多,并已在实际应用中取得了良好效果,但在水产动物方面的研究[15]极少,且仍停留在初始基础性研究阶段。本研究中,拟探讨高温应激情况下,两种中草药单方及一种自组中草药复方免疫添加剂对施氏鲟非特异性免疫能力的影响,以筛选适用于养殖鲟使用的抗热应激中草药免疫添加剂。

1 材料与方法

试验用健康非免疫状态下1+龄施氏鲟体质量为(92±4.73)g,购自中国水产科学研究院鲟鱼繁育技术工程中心。试验用中草药均购自哈药集团世一堂药店,烘干粉碎后备用;溶菌酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所;嗜水气单胞菌Aeromonashy drophila(Ah)菌株为黑龙江水产研究所鉴定保存菌株。

1.2.1 中草药水煎剂的制备将所选鱼腥草、当归和方四(以党参、白术为主药,茯苓、当归等为辅药)准确称取,放入砂锅中,加水浸泡30 min,分别以30、45 min熬制两次,合并所得药汁后再浓缩成100 mL[其中1 mL药液相当于1 g药方(干物质)的水煎剂],高压灭菌后于冰箱(4℃)中保存备用。

1.2.2 试验设计试验中每组设两个平行,每个平行放30尾试验鲟,于室内循环水族箱(22℃)中暂养两周,每天按鱼体质量的2.0％投喂全价基础饲料。

暂养结束后,按照鱼腥草、当归、方四分别为0.54、0.30、0.80 g/kg(体质量)的给药剂量对试验鲟进行口灌给药,每日1次,连续14 d。停药24 h后,从各组分别取半数试验鲟于30℃控温水族箱中热刺激2 h。自试验鲟尾动(静)脉采血,并解剖取其鳃、肝、幽门盲囊、胃、肠等组织样品,立即于超低温冰箱(-80℃)中保存备用。

1.2.3 指标的测定与计算试验鲟血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白含量均采用Beckman公司生产的CYNCHRON CH4PRO全自动生化分析仪进行检测。参照王树芹等[16]的方法测定白细胞吞噬率,计算公式为

吞噬率=参与吞噬的白细胞数/100个白细胞×100％,

吞噬指数=白细胞吞噬的嗜水气单胞菌数/参与吞噬的白细胞数。

准确称取试验鲟各组织样品与预冷的生理盐水按质量(g)与体积(mL)比为1∶9稀释,充分匀浆后,离心,取上清液,将血清在37℃下水浴融化后,参照刘红柏等[17]的方法检测溶菌酶活性。

试验数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,采用最小显著差数法(LSD)进行组间比较,显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 鲟血清中蛋白含量的变化

分别检测各试验组常温及高温应激后血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLU)含量的变化,并计算白蛋白与球蛋白比例(ALB/ GLU),结果如表1所示。从表1可见:高温应激组鲟血清中TP、ALB、GLU含量和ALB/GLU均高于相对应的常温组;高温应激后,TP、ALB、GLU含量的最大值均出现在对照组,而最小值均出现在鱼腥草组。多重比较结果表明:方四和鱼腥草组试验鲟高温应激后ALB、GLU含量和ALB/GLU均显著低于对照组(P＜0.05);当归组常温下TP和GLU含量显著高于对照组(P＜0.05),而ALB/ GLU和高温下ALB含量则显著低于对照组(P＜0.05)。

2.2 鲟白细胞吞噬作用的变化

从表2可见:高温应激后,对照组和方四组试验鲟白细胞吞噬率、吞噬细菌数和吞噬指数均高于常温组,而当归、鱼腥草组则相反,均低于相对应的常温组;3个测定指标常温组的最大值均出现在当归组,最小值均出现在方四组,而高温应激组的最大值均出现在方四组,最小值均出现在鱼腥草组;4个试验组常温及高温应激后白细胞吞噬率均未形成显著性差异(P＞0.05),但当归和鱼腥草组常温情况下,吞噬细菌个数和吞噬指数均显著高于对照组和方四组(P＜0.05),而高温应激后则显著低于对照组和方四组(P＜0.05)。

2.3 鲟各组织中溶菌酶活性的变化

从表3可见:对照组鲟各组织中溶菌酶活性表现为肝＞血清＞鳃,高温应激后,各试验组鲟的血清、肝和鳃中溶菌酶活性均低于相应的常温组;常温及高温应激后,3种组织中溶菌酶活性最大值均出现在方四组,血清和肝中最小值出现在当归组,而鳃中最小值则出现在对照组。多重比较结果表明:常温及高温应激后,方四和鱼腥草组的血清和鳃中溶菌酶活性均显著高于对照组(P＜0.05);而当归组血清和肝中溶解酶活性显著低于对照组(P＜0.05),鳃中溶菌酶活性则显著高于对照组(P＜0.05)。

从表4可见,对照组鲟消化道组织中溶菌酶活性表现为肠＞幽门盲囊＞胃,高温应激后,各试验组鲟3种组织中溶菌酶活性均低于相应的常温组。多重比较结果表明:常温及高温应激后,方四组胃溶菌酶活性显著高于对照组(P＜0.05),而肠中则显著低于对照组(P＜0.05);当归组幽门盲囊和肠中溶菌酶活性显著低于对照组(P＜0.05),而胃中则显著高于对照组(P＜0.05);鱼腥草组幽门盲囊中溶菌酶活性显著高于对照组(P＜0.05),而肠中则显著低于对照组(P＜0.05)。

3 讨论

有研究表明,影响鱼体免疫功能的因素很多,其中影响最大的是环境因素中的温度[18-20]。适度的应激对机体有利,但过强或持续时间过长的应激对机体有害,会打破鱼类与环境间的平衡,引起生理和免疫反应的变化[21]。高水温可导致鲟机体白细胞吞噬能力下降,产生抗体“无效免疫”,从而显著抑制鲟的非特异性免疫[7]。

3.1 中草药免疫制剂对血清蛋白含量的影响

总蛋白是血清的重要组成部分,在机体免疫反应中起着重要作用[22],血清中总蛋白、白蛋白和球蛋白水平的变化可作为反映鱼体应对外界应激时自身免疫应答强弱的重要指标[23]。本试验结果表明,高温热应激后,试验鲟血清内总蛋白、白蛋白、球蛋白含量和白蛋白/球蛋白值均有所上升,此结果可能与鱼体应激时需要大量分解组织中储存的能量来满足生理需要有关[24],表明机体对高温应激做出了应激反应,促使血液中作为营养物质载体、机体蛋白质来源的白蛋白[25]和具有免疫功能的球蛋白[26]含量升高。本试验中,3个给药组试验鲟高温应激后血清中蛋白含量的上升幅度均小于对照组,表明中草药制剂有效抑制了机体的异常激烈反应,降低了营养物质的异常消耗,维持了机体内环境平衡,其中方四和鱼腥草效果尤其明显。

3.2 中草药免疫制剂对白细胞吞噬作用的影响

吞噬作用是动物非特异性免疫功能的重要组成部分,吞噬细胞在鱼类防御外来微生物感染过程中必不可少[27]。本试验结果显示,受高温热应激影响,试验鲟白细胞吞噬率、吞噬细菌数和吞噬指数升高,与已报道的水温适当升高可促进水产动物细胞的吞噬作用相一致[28],但也有报道指出,温度过高或过低会对吞噬作用产生抑制性影响[29]。本试验常温情况下,吞噬率、吞噬细菌数和吞噬指数3个检测指标的最高值均出现在当归组,表明当归可有效提高试验鲟细胞吞噬功能,此结果与陈孝煊等[27]、林旋等[30]报道的大黄、黄芪多糖等中草药及其有效成分能提高鱼体细胞吞噬作用的结果相一致;而高温热应激后,当归促进作用减弱,检测指标的最大值均出现在方四组。这表明常温情况下,当归可促进机体吞噬作用,而方四具有有效提高高温热应激后机体细胞吞噬作用的效果,能提高机体抗高温应激能力,并维持机体的高免疫力状态。

3.3 中草药免疫制剂对机体组织溶菌酶活性的影响

溶菌酶是水生动物血淋巴细胞酶系统中的重要组成部分,是机体应对细菌病原体感染的重要防御屏障,可反映机体非特异性免疫水平的变化[31]。本试验中,与已报道的鱼体受急性应激时肝脏受损、血清中溶菌酶活力会显著上升[26]的结果不同,高温热应激后试验鲟组织中溶菌酶活性均低于常温试验组。试验所选方四能有效提高肝、血清、鳃和胃组织中的溶菌酶活性,这与已报道的中草药复方具有提高鱼体溶菌酶活性[32]的结果相一致;且在高温应激后仍能保持其效果,对保持鲟机体抗病力,抵抗热应激胁迫具有较好作用。鱼腥草和当归虽然也能提高部分鲟组织中(如血清和鳃)溶菌酶活性,但对其他组织酶活性无显著影响,甚至有抑制作用,其具体作用机制尚需进一步深入研究。

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Screening of Chinese herbalmedicines related to anti-heat stress in Amur sturgeonAcipenser schrenckiiBrandt

WANG Di,LIU Hong-bai
(Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China)

Abstract：Effects of several Chinese herbal medicines on immune ability of 1+old Amur sturgeonAcipenser schrenckiiBrandtwere investigated at normal and high temperature to screen anti-heat stress Chinese herbalmedicines in Amur sturgeon culture.Amur sturgeon were divided into 4 groups at a density of30 fish in one group and orally administrated by Chinese herbalmedicinesAngelica sinensis,Houttuyniacordataand prescription IV(PIV)at a dose of0(distilled water,as control group),0.30,0.54 g/kg or0.80 g/kg body weightonce a day for14 d with duplication.After the withdrawal of 24 h,half of the fish in each group were thermally stimulated at30℃for 2 h and then the bloodswere sampled together with the normal temperature groups at22℃.The protein contents,cell phagocytosis in serum and lysozyme activities in several tissues were detected.The results showed that PIV andHouttuyniacordataeffectively inhibited the increase in serum protein levels in the fish exposed to the heat stress. The phagocytosis function was improved in the fish under normal temperature byAngelica sinensis,while PIV led to effectively increase the cell phagocytosis,and to effectively improve the lysozyme activities in liver,serum,gill and stomach and homeostasis in the fish under high temperature.In summary,it is conferred that PIV effectivelymaintains homeostasis and promotes cell phagocytosis and lysozyme activity,being used as the anti-heat stress Chinese herbalmedicine for further study.

Key words：Acipenser schrenckiiBrandt;Chinese herbalmedicine;anti-heat stress

作者简介：王荻(1980—),女,博士,助理研究员。E-mail:wangdi_2014@163.com

通信作者：刘红柏(1970—),女,博士,研究员。E-mail:liuhongbai@sina.com