图1 褐藻聚糖硫酸酯梯度洗脱曲线
Fig.1 Gradient elution curve of fucoidan
摘要：为研究马尾藻Sargassum褐藻多糖硫酸酯的组成及结构，以马尾藻褐藻多糖硫酸酯粗品为原料，利用DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析对粗品进行分离纯化，采用高效液相色谱法（HPLC）对粗品（F）及纯化后的两个组分（F0、F1）进行了单糖组成分析，同时利用红外光谱法、核磁共振波谱法研究了F0及F1的多糖结构。结果表明：用高效液相色谱法对单糖衍生物的分离效果良好，F、F0、F1均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖；红外光谱分析显示，F和F0的硫酸基主要连接于岩藻糖的C2和C3位置。本研究结果可为马尾藻褐藻多糖硫酸酯的生物活性研究奠定基础。
关键词：马尾藻；褐藻多糖硫酸酯；纯化；结构分析
马尾藻Sargassum隶属于褐藻门、圆子纲、墨角藻目、马尾藻科。据报道，全世界约有马尾藻属海藻250多种，中国是马尾藻主要产地之一［1］，约有60种，主产于广东、广西沿海，海南岛、洲岛和涠洲岛最为常见，其中海蒿子、海黍子、鼠尾藻、匍枝马尾藻等为主要品种。马尾藻是重要的大型经济海藻，价格低廉，原料丰富，营养价值高，含有多种维生素、矿物质［2］，富含褐藻胶、褐藻糖胶和甘露醇等，因此，马尾藻可作为生产褐藻胶等的重要原料或直接食用原料，其中褐藻糖胶也称褐藻多糖硫酸酯，是一种广泛存在于褐藻中的硫酸化多糖。由于海藻种类、生长季节和海藻各个部位差异以及提取分级手段不同，其化学组分会出现较大的不同［3］。褐藻多糖硫酸酯主要是由L-褐藻糖-4-硫酸酯和有机硫酸酯组成的杂环糖，其单糖组成包括半乳糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、甘露糖，还有少量的蛋白质和钾、钠、钙、镁等金属离子［4-5］。褐藻多糖硫酸酯因其具有降血脂、抗炎、抗肿瘤、抗凝血、保肝护肝等生物活性［6-8］，已成为研究热点之一。本研究中，以马尾藻褐藻多糖硫酸酯粗品为原料，利用高效液相色谱法（HPLC）分析了经分离纯化得到的马尾藻褐藻多糖硫酸酯各组分的单糖组成，利用红外光谱法、核磁共振波谱法研究了多糖结构，旨在为马尾藻褐藻多糖硫酸酯的生物活性研究提供指导。
1.1 材料
试验用马尾藻褐藻多糖硫酸酯由国家海藻加工技术研发分中心提供，提取方法与工艺流程参考Wang等［7］的方法。DEAE-Sepharose Fast Flow为Pharmacia进口分装，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖等标准糖购于Sigma公司，氢氧化钠、磷酸氢二钠均购于天津博迪化工有限公司，磷酸二氢钾购于天津市科密欧化学试剂开发中心。
试验仪器主要有安捷伦1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）、Nexus 470 FT-IR型傅里叶红外光谱仪（美国Nicolet公司）、FD-4冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）、721型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 褐藻多糖硫酸酯的分离纯化 称取0.4 g马尾藻褐藻多糖硫酸酯粗品，溶于20 mL 0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（pH为7.4）中，将溶液经DEAE-Sepharose Fast Flow分离纯化；以添加0～2.5 mol/L NaCl溶液的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，流速为0.75 mL/min，每管3 mL，用自动部分收集器收集；每隔5管，用苯酚-硫酸法［9］测定其总糖含量，绘制洗脱曲线，然后收集洗脱峰，进行透析、冷冻干燥。计算各馏分收集得率，通过苯酚-硫酸法测定各馏分的总糖含量，通过明胶-BaCl2法［4］测定其硫酸根含量。
1.2.2 用高效液相色谱法分析样品的单糖组成使用装有Agela·Venusil XBP-C18（2）色谱柱和紫外检测器（DAD）的Agilent 1260高效液相色谱仪，采用柱前衍生高效液相法分析样品的单糖组成。进样体积为20μL，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。流动相A为15％乙腈+50 mmol/L磷酸缓冲液（KH2PO4-NaOH，pH 6.0），流动相B为40％乙腈+50 mmol/L磷酸缓冲液（KH2PO4-NaOH，pH 6.0），时间为0、10、55、56 min，相应缓冲液的浓度为100％、85％、50％、100％。
1.2.3 红外光谱法分析 将干燥的各待测样品与KBr压制成片，使用Nicolet-Nexus 470傅里叶变换红外光谱仪，扫描4000～400 cm-1波长范围内的光谱吸收值。
1.2.4 核磁共振波谱法分析 将各馏分分别用氘水溶解、冻干，重复两次，再溶解于氘水中，在温度为25℃、500 MHz条件下，用Bruker AVANCEⅢ核磁共振波谱仪于（-5～220）×106下进行13C谱扫描分析。
2.1 褐藻多糖硫酸酯的分离纯化结果
马尾藻褐藻多糖硫酸酯经DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析和NaCl溶液洗脱后，根据苯酚-硫酸法检测其多糖含量，洗脱分离获得两个组成成分，分别命名为F0和F1，如图1所示。其中F0为流出峰，F1为洗脱峰，F0和F1的得率及F、F0和F1的多糖和硫酸根含量如表1所示。
2.2 褐藻多糖硫酸酯的单糖组成分析
褐藻多糖硫酸酯单糖组成的HPLC色谱图如图2所示，马尾藻褐藻多糖硫酸酯粗糖（F）的甘露糖左右两侧分别出现两个未知峰，经计算其含量分别为11.38％和2.54％，这两个未知峰可能为甘露糖的同分异构体。通过与标准单糖保留时间分析比较，确定样品的单糖种类及含量，马尾藻褐藻多糖硫酸酯F和F0、F1的单糖组分主要有半乳糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和木糖。
图1 褐藻聚糖硫酸酯梯度洗脱曲线
Fig.1 Gradient elution curve of fucoidan
图2 粗品F、F0和F1单糖组成的液相色谱图
Fig.2 M onosarccharide composition profile of the crude fucoidan F，F0 and F1 by liquid chrom atography
2.3 多糖结构分析
2.3.1 红外光谱分析 红外光谱分析显示（图3）：在3427～3404 cm-1附近出现吸收峰，应为OH伸缩振动；2943～2941 cm-1附近出现的振动应为C-H伸缩振动，是岩藻糖中甲基的吸收峰；2908 cm-1处是-CH3伸缩振动的特征吸收峰；1420～1413 cm-1附近出现的吸收峰可能为S=O伸缩振动，F、F0、F1分别在819、822、830 cm-1处有伸缩振动，说明有C-O-S存在，且F、F0和F1的硫酸基主要连接于岩藻糖的C2或C3位置［10］；1039～1037 cm-1附近是C-O-C、C-O-H结构中的C-O变角振动；891～878 cm-1附近是β-D-葡萄吡喃糖的特征吸收，F1在891 cm-1的吸收峰是吡喃糖β异构体的特征峰。
2.3.2 核磁共振波谱分析 从图4可见：F0的13C的NMR图谱十分复杂，难以完全解释；F1的13C图谱显示，有6个清晰的碳信号，102.66×10-6处化学位移表明含有α型吡喃糖，（60～80）×10-6处化学位移表明有未取代的C-2、C-3、C-4、C-5信号，17.95×10-6处化学位移表明有带α-L-岩藻糖吡喃糖残基［14］；从峰高可以看出，F0的岩藻糖含量较高，与高效液相色谱分析结果一致。
表1 马尾藻褐藻多糖硫酸酯粗多糖和各组分的化学组分分析
Tab.1 Chem ical composition of crude fucoidan and different fucoidan fractions from Sargasso weed Sargassum％
组分fraction单糖组成得率yield硫酸根含量总糖含量sugar content SO2-4content monosaccharide composition甘露糖Man鼠李糖Rha葡萄糖醛酸Glu-UA葡萄糖Glu半乳糖Gal木糖Xly岩藻糖.74 F0 17.66 24.11 50.64 18.29 5.72 12.89 5.90 23.22 9.92 24.06 F1 30.30 21.56 53.16 18.75 6.23 10.64 4.93 20.0 Fuc F—16.18 41.76 15.70 3.75 9.00 10.34 21.67 8.04 15 9 12.57 18.19
图3 粗品、F0、F1的红外光谱图谱
Fig.3 Infrared spectrum of crude Fucoidan，F0 and F1
图4 F0、F1的13C-核磁共振谱图
Fig.4 The13C NMR spectra of F0 and F1
据国内外文献报道，褐藻多糖硫酸酯化学组成非常复杂，不仅含有岩藻糖、硫酸基等组分，还含有半乳糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖等其他组分。Li等［11］研究表明，马尾藻褐藻多糖硫酸酯纯化后的3个组分主要含有岩藻糖、甘露糖和半乳糖。马伟伟［12］研究表明，海黍子褐藻多糖硫酸酯主要由岩藻糖组成，含量均在30％以上，其次为半乳糖、甘露糖，含量在20％左右，此外，还含有少量的阿拉伯糖和木糖。刘舒［13］分析多肋藻褐藻多糖硫酸酯粗品单糖组成，其组分CF1、CF2、CF3和CF4单糖组成比例均不相同：组分CF1主要由半乳糖、岩藻糖组成；CF2主要由甘露糖、葡萄糖、岩藻糖组成；CF3主要由岩藻糖、葡萄糖、木糖组成；CF4主要由岩藻糖、木糖、葡萄糖组成。王晶［14］检测出海带褐藻多糖硫酸酯的各组分均由岩藻糖、半乳糖等糖基组成。Bilan等［15］以不同条件纯化Saccharina latissima褐藻多糖硫酸酯后得到的各组分均含有岩藻糖、木糖、甘露糖。本研究中，马尾藻褐藻多糖硫酸酯的组分F0、F1主要由甘露糖、半乳糖、岩藻糖组成。不同褐藻多糖硫酸酯的单糖组成与其含量的差异，与褐藻的产地、品种、多糖的提取工艺有关。
红外光谱分析表明，褐藻多糖硫酸酯的特征吸收峰主要是由于硫酸多糖和硫酸盐的存在，如1254～1252 cm-1处的硫酸酯（S=O）和830～819cm-1处的硫酸盐（C-O-S），这与Huang等［16］的观点一致。郭峰君等［17］曾报道，C-O-S伸缩振动峰的位置与多糖链上硫酸根的位置有关，吸收峰在820 cm-1左右的，是连接在岩藻糖C2或C3位置平伏键上的硫酸根。张全斌等［18］发现，冬青叶马尾藻和海黍子褐藻多糖硫酸酯的该吸收峰分别位于813 cm-1和820 cm-1，表明它们的硫酸根连接于糖的C2或C3位置。本研究中马尾藻褐藻多糖硫酸酯在841 cm-1处有吸收，说明它的硫酸根主要连接在糖的C4位置。此结果与郭峰君等［17］、张全斌等［18］得出的硫酸根的连接位置一致。
本研究中，F0、F1的13C NMR图谱的高强度信号区为（18.5～21.5）×10-6，F0、F1位于（65～83）×10-6处的信号峰为吡喃环的C2～C5信号，这可能是由单糖的糖基化、硫酸化和酰基化引起的。这与Wang等［7］曾报道的多肋藻F1、F3和F4核磁分析结果一致。
参考文献：
［1］ 曾呈奎，陆保仁.中国海藻志［M］.北京：科学出版社，2000：35.
［2］ 谌素华，王维民，刘辉，等.亨氏马尾藻化学成分分析及其营养学评价［J］.食品研究与开发，2010，31（5）：154-156.
［3］ Hong SW，Lee H S，Jung K H，et al.Protective effect of fucoidan against acetaminophen-induced liver injury［J］.Archives of Pharmacal Research，2012，35（6）：1099-1105.
［4］ 钟思燕，王维民，谌素华，等.不同分子质量马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备和化学组成分析［J］.食品与发酵工业，2015，41（6）：70-75.
［5］ 刘舒，汪秋宽，何云海，等.厚叶海带生物活性成分的研究现状［J］.水产科学，2013，32（6）：361-367.
［6］ 王亚芳，张海霞，汪秋宽，等.几种褐藻多糖硫酸酯粗提物的降血脂作用［J］.食品科技，2015，40（2）：247-253.
［7］ Wang Qiukuan，Song Yuefan，He Yunhai，et al.Structural characterisation of algae Costaria costata fucoidan and its effects on CCl4-induced liver injury［J］.Carbohydrate Polymers，2014，107：247-254.
［8］ 王庆钧，谷越，杨颖，等.萱藻中岩藻聚糖硫酸脂的提取工艺优化及其保肝护肝作用［J］.大连海洋大学学报，2015，30（4）：417-421.
［9］ 张惟杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海：上海科学技术出版社，1987：6-7.
［10］ Bilan M I，Grachev A A，Shashkov A S，et al.Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L.［J］.Carbohydrate Research，2006，341（2）：238-245.
［11］ Li Bo，Wei Xinjun，Sun Junliang，et al.Structural investigation of a fucoidan containing a fucose-free core from the brown seaweed，Hizikia fusiforme［J］.Carbohydrate Research，2006，341（9）：1135-1146.
［12］ 马伟伟.海黍子褐藻多糖硫酸酯的分离纯化及生物功能研究［D］.烟台：烟台大学，2013.
［13］ 刘舒.三种褐藻中岩藻聚糖硫酸酯的纯化及结构分析［D］.大连：大连海洋大学，2013.
［14］ 王晶.海带褐藻多糖硫酸酯的结构、化学修饰与生物活性研究［D］.青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），2010.
［15］ Bilan M I，Grachev A A，Shashkov A S，et al.Further studies on the composition and structure of a fucoidan preparation from the brown alga Saccharina latissima［J］.Carbohydrate Research，2010，345（14）：2038-2047.
［16］ Huang C Y，Wu S J，Yang Wenning，et al.Antioxidant activities of crude extracts of fucoidan extracted from Sargassum glaucescens by a compressional-puffing-hydrothermal extraction process［J］. Food Chemistry，2016，197：1121-1129.
［17］ 郭峰君，胡靖，赵雪.海带岩藻聚糖硫酸酯降解及基本结构分析［J］.食品工业科技，2014，35（18）：93-97.
［18］ 张全斌，徐祖洪.几种褐藻中褐藻多糖硫酸酯的分离及分析［J］.海洋科学，1997（3）：55-58.
Purification and structure of fucoidan from Sargasso weed Sargassum
Abstract：The fucoidan in Sargasso weed Sargassum was purified by DEAE-Sepharose Fast Flow anion-exchange chromatography and the structure characteristics of the fucoidan fractions（F0 and F1）in the crude fucoidan（F）were analyzed by infrared spectrum（IR），high performance liquid chromatography（HPLC）and nuclearmagnetic resonance（NMR）spectroscopy to evaluate themonosarccharide composition and structure of fucoidan from Sargasso weed.The HPLC revealed thatmonosaccharide composition of these fractionswere comprised ofmannose，glucuronic acid，galactose，and fucose，with a little amountof rhamnose，glucose and xylose.The IR revealed that the sulfate site of F and F0 were located at Fuc C2 and C3.The findings provide basic data for the biological activity studies of the fucoidan from Sargasso weed.
Key words：Sargassum；fucoidan；purification；structural analysis
中图分类号：TS254.1
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.05.015
文章编号：2095-1388（2016）05-0559-04
收稿日期：2016-04-20
基金项目：海洋公益性行业科研专项（201405040）；辽宁省科技厅项目（2014205008）