图1 海七鳃鳗pma-m iR-200c-3p序列与斑马鱼、人类、大鼠和小鼠m iR-200c-3p序列的保守性分析
Fig.1 Sequence conservation analysis ofm iR-200c-3p among sea lam prey，zebrafish，human，rat and m ouse
摘要：为研究海七鳃鳗Petromyzon marinus pma-miR-200c-3p在心脏发育过程中的生物学功能，采用显微注射技术，将pma-miR-200c-3p模拟体注射到斑马鱼Danio rerio胚胎，过表达pma-miR-200c-3p后，使用qRT-PCR及Western blot法检测了一些与心脏发育相关的标志性基因的表达水平，以及BMP/Smad通路重要基因蛋白水平的变化，并利用生物信息学预测、GFP荧光表达分析了pma-miR-200c-3p的生物学作用。结果表明：过表达pma-miR-200c-3p的斑马鱼胚胎中，与心脏发育相关的标志性bmp4、bmp5、smad1、gata5、tbx2b和notch1a基因的表达水平极显著上调（P＜0.01），同时BMP/Smad通路中BMP4、Smad1、GATA5蛋白表达水平也明显升高；细胞试验表明，cdx1b基因可能是pma-miR-200c-3p的一个靶基因。研究表明，pma-miR-200c-3p可能通过抑制cdx1b基因的表达，参与BMP/Smad通路以促进心脏发育。
关键词：海七鳃鳗；miR-200c-3p；斑马鱼；心脏发育；cdx1b
心脏作为胚胎发育过程中最早形成的器官之一，为其他器官的发育和生长提供氧气和营养，并参与机体的生命活动［1］。心脏的形成是一个复杂的动态过程，首先，心脏由形状、大小一致的心肌细胞组装成线性管状结构，接着线性管状结构发生环化，心肌细胞增大、延伸、细胞迁移［2］，心室、心房膨大，最终形成成熟的器官［3］。心脏的发育受到多种特异转录因子和信号通路的精确调控，微小的失调都可能造成先天性心脏缺陷，甚至导致胚胎死亡［3］。心管的形成需要GATA家族（GATA4、GATA5和GATA6）特异性转录因子的参与［4］，如BMP4参与了心脏环化和不对称发育［5］。同时，心脏的发育也需要BMP/Smad［6］、Wnt［7］、Notch［8］等通路的调控；这些通路上的基因与特异性转录因子结合，形成复杂的基因调控网络并相互作用。近期研究表明，越来越多的基因会参与心脏的发育。Lengerke等［9］发现，在小鼠分化的胚胎干细胞（ESC）中，cdx1和cdx4基因的过表达会严重抑制心脏发育；Chu等［10］发现，低剂量的cdx1能够诱导心外膜细胞的转移和分化。此外，近年来microRNA对心脏发育的调节也受到广泛关注。
microRNA是一类21～25nt相对保守的非编码RNA［11］，在转录后水平上调控基因的表达。microRNA参与了不同的生命活动，调控着众多基因的表达。至今已发现许多microRNA，其对应的靶基因及生物学功能已被广泛研究。在心脏中，一些microRNA通过调控离子通道［12］、心肌肥大［13-16］，参与心肌纤维化［17］等来调控心脏的发育。miR-200c属于miR-200家族的成员之一，研究发现，miR-200c-3p在卵巢癌［18］、宫颈癌［19］、肺癌［20］等癌细胞中高表达；此外，miR-200c通过靶向抑制CDH1、ZEB1的表达，从而抑制上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）［21］；而miR-200c在心脏方面的作用研究尚未见报道。
七鳃鳗Lampetra japonica隶属于圆口纲Cyclostomata、七鳃鳗目Petromyzoniformes、七鳃鳗科Petromy-zonida［22］，是目前已知最古老的脊椎动物中唯一的幸存者，是脊椎动物发育生物学研究的重要模式生物［23］。海七鳃鳗Petromyzon marinus是被用于研究最多的一种七鳃鳗。本研究前期工作中，通过高通量小分子RNA测序发现，海七鳃鳗pmamiR-200c-3p在胚胎心脏中表达量上调，推测其可能参与了心脏的发育。为研究海七鳃鳗pmamiR-200c-3p在心脏发育中的功能，本研究中比较了miR-200c-3p在不同物种中的种子序列，发现其在物种进化中非常保守，因此，以斑马鱼为研究对象，注射pma-miR-200c-3p模拟体（mimics）使之过表达，检测其与心脏发育相关的标志性基因及BMP/Smad通路中重要基因蛋白的表达，并通过细胞试验，验证了斑马鱼的cdx1b可能是pma-miR-200c-3p的一个靶基因，研究结果初步揭示了pma-miR-200c-3p对斑马鱼心脏发育的影响。
1.1 材料
试验用主要仪器和试剂有Roche LightCycler480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪（Roche480）；pmamiR-200c-3p mimics和标准NC（Negative control，NC）（上海吉玛基因）；PMD-18-T载体、PCR rTaq酶、T4连接酶（TaKaRa）；胶回收试剂盒（OMEGA）；HindⅢ和SacⅡ限制性内切酶（NEB）；质粒抽提试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司，以下简称生工）；去内毒素质粒抽提试剂盒（GeneMark）；组织蛋白裂解液（生工）；真核表达载体EGFP-C2（本实验室自有）；Prime-ScriptTM RT reagent Kit（TaKaRa）；GFP一抗（兔抗，GenTex）、BMP4一抗（兔抗，GenTex）、Smad1/5/9一抗（兔抗，Abcam）、GATA5一抗（兔抗，LSBio）、HRP标记的二抗（羊抗兔，Cell Signaling）、Actin一抗（兔抗，生工）；DMEM-高糖培养基（Hyclone）、胎牛血清（Gibco）、转染试剂（QIAGEN）。
1.2 方法
1.2.1 pma-miR-200c-3p保守性分析 从miRBase网站上（http：//www.mirbase.org/）找到斑马鱼、大鼠、人类和小鼠的miR-200c-3p序列，与pma-miR-200c-3p的序列进行比对分析。
1.2.2 microRNA mimics显微注射 pma-miR-200c-3p mimics合成序列为UAACACUGUCUGGUAAUGAUGUU，标准NC（作为阴性对照）序列为UUCUUCGAACGUGUCACGUTT。将pma-miR-200c-3p以及NC的浓度配制成10μmol/L，分别注射到Ⅰ细胞期斑马鱼的动物极中，每个胚胎注射1 nL左右，对照组和试验组分别注射200枚胚胎。注射后的斑马鱼胚胎置于纯净水中培养72 h，统计斑马鱼胚胎的死亡率以及心脏增大的胚胎数。
1.2.3 定量qRT-PCR 将浓度为10μmol/L的pma-miR-200c-3p和NC分别注射到Ⅰ细胞期的斑马鱼胚胎中，每个胚胎注射1 nL，受精后72 h后收集胚胎（试验组和对照组WT、NC分别取60枚胚胎），用Trizol提取RNA，反转录成cDNA后，进行定量qRT-PCR，反应结束后进行溶解曲线分析以及计算不同样品的2-△△Ct值，用SPSS 13.0软件进行One-Way ANOVA分析，比较注射pmamiR-200c-3p和对照组WT、NC斑马鱼胚胎中与心脏发育相关的标志性基因bmp4、bmp5、smad1、gata5、tbx2b和notch1a的表达水平，同时检测cdx1b的表达水平。以β-actin作为内参基因。
1.2.4 Western blot检测 将浓度为10μmol/L的pma-miR-200c-3p和NC分别注射到Ⅰ细胞期的斑马鱼胚胎中，每个胚胎注射1 nL，受精后72 h收集胚胎，试验组和对照组（WT、NC）分别取40枚胚胎，用1×PBS洗3次，加入组织蛋白裂解液A和B液（100∶1），充分裂解后，加入巯基乙醇和Loading buffer，沸水中煮10 min，使之变性。取150μg蛋白进行10％SDS-PAGE蛋白胶电泳，用孔径为0.45μm的PVDF膜（Millipore）在250 mA下转膜1 h。封闭后，分别用一抗BMP4、Smad1/5/9、GATA5（1∶1000）和Actin（1∶2000）孵育过夜，用PBST洗涤3次，每次5 min，再用二抗孵育（1∶2000），室温下静置1 h。用PBST洗涤，加入显影液，使用化学发光成像仪成像，并用Western blot法检测这些蛋白的表达水平。
1.2.5 miR-200c-3p靶基因的预测 通过microRNA的靶基因预测软件TargetScan（http：// www.targetscan.org/）、Microcosm Targets（http：// www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl）等来预测pma-miR-200c-3p的靶基因，其中斑马鱼的cdx1b是其靶基因之一。
1.2.6 靶基因cdx1b的验证 从受精后72 h斑马鱼胚胎的cDNA中扩增出斑马鱼cdx1b的一段3′-UTR序列。将扩增的片段克隆到pMD18-T载体上，用HindⅢ和SacⅡ酶双酶切后将目的片段连接到pEGFP-C2真核表达载体中，用去内毒素质粒抽提试剂盒提取阳性质粒。
用Attractene转染试剂将EGFP-C2和NC、pma-miR-200c-3p分别共转染293T细胞，NC和miR-200c-3p转染终浓度均为10μmol/L。293T细胞转染后24 h，用PBS洗3次，加入组织蛋白裂解液充分裂解后，利用Western blot法检测GFP（1∶5000）和Actin（1∶2000）蛋白的表达水平。
2.1 m iR-200c-3p在不同物种中的保守性分析
在miRBase数据库中发现，斑马鱼、人类、大鼠和小鼠这4个物种的种子序列一致，而七鳃鳗pma-miR-200c-3p的种子序列与以上物种相比，只有第4位一个碱基的差异（图1）。但是碱基C和U都是嘧啶，与碱基G都能够互补配对。并且，对于成熟的miR-200c-3p序列来说，这5个物种的序列差异很小。因此，就进化而言，miR-200c-3p在七鳃鳗以及这4个物种中是保守的。这为以斑马鱼为生物模型来研究pma-miR-200c-3p对心脏发育的影响提供了有效的理论依据。
图1 海七鳃鳗pma-m iR-200c-3p序列与斑马鱼、人类、大鼠和小鼠m iR-200c-3p序列的保守性分析
Fig.1 Sequence conservation analysis ofm iR-200c-3p among sea lam prey，zebrafish，human，rat and m ouse
2.2 斑马鱼胚胎心脏增大及存活率统计
显微注射后，将胚胎培养到受精后72 h，此时的胚胎正好处于脱膜阶段，且色斑较少，便于观察心脏的发育情况，故选择72 h的胚胎进行观察并统计。根据死亡率以及心脏畸形表型的统计（图2），发现注射pma-miR-200c-3p的胚胎死亡率较高，且心脏增大这种表型的胚胎占20％左右。因此，就斑马鱼心脏表型而言，pma-miR-200c-3p可能影响斑马鱼心脏的发育。
2.3 pma-m iR-200c-3p对心脏发育过程中一些
标志性基因的影响
在心脏发育过程中，需要许多重要的转录因子和信号通路参与其调控过程。qRT-PCR结果表明，与对照组WT和NC胚胎相比，过表达pma-miR-200c-3p的斑马鱼胚胎中bmp4/5、smad1、tbx2b和notch1a基因的表达水平发生了极其显著上升（P＜0.001），gata5基因表达量也发生了极显著提高（P＜0.01）（图3）。可见，过表达pma-miR-200c-3p能够显著提高心脏中一些标志性基因的表达水平，这表明pma-miR-200c-3p能够促进心脏的发育。
图2 斑马鱼心脏增大及存活率统计
Fig.2 Percent of heart enlargement and survival rate in zebrafish
注：WT为野生型斑马鱼胚胎；NC为注射阴性对照寡核苷酸的斑马鱼胚胎；pma-miR-200c-3p为注射了pmamiR-200c-3p mimics的斑马鱼胚胎；normal为心脏正常的胚胎；dead为死亡的胚胎；heart enlargement为心脏增大的斑马鱼胚胎，下同
Note：WT，wild type of zebrafish embryos；NC，the embryos injected by oligonucleotides in negative control；pma-miR-200c-3p，the embryos injected by pmamiR-200c-3pmimics；normal，embryoswith normal heart；dead，embryos died；heart enlargement，cardiac enlargement of embryos，et sequentia
图3 与心脏发育相关的标志性基因的表达量变化
Fig.3 Changes in expression of severalmarker genes related to heart developm ent
注：**表示与WT和NC对照组有极显著性差异（P＜0.01）；***表示与WT和NC对照组有极其显著性差异（P＜0.001），下同
Note：**means significant difference compared with the WT and NC（P＜0.01）；***means very significant difference compared with theWT and NC（P＜0.001），et sequentia
2.4 pma-m iR-200c-3p对BMP/Smad1通路的影响
从qRT-PCR结果中发现，过表达pma-miR-200c-3p后，BMP4、Smad1和GATA5蛋白的表达量上升，而这3个转录因子是BMP/Smad信号通路中的重要组成，正常的心脏发育过程受到BMP/ Smad通路的调控。为了验证这3种转录因子在蛋白水平上是否发生变化，用Western blot法检测受精后72 h斑马鱼胚胎中BMP4、Smad1和GATA5蛋白的表达水平。与对照组WT和NC胚胎相比，过表达pma-miR-200c-3p的斑马鱼胚胎中，BMP4蛋白表达水平升高；Smad1和GATA5蛋白的表达量也都有一定的上升（图4）。结果表明，pmamiR-200c-3p能够通过促进BMP/Smad1通路中一些基因的表达，进而促进心脏的发育。
图4 用W estern blot法分析pma-m iR-200c-3p斑马鱼胚胎的BM P/Smad通路
Fig.4 The pma-m iR-200c-3p increases the expression of BM P/Smad pathway in zebrafish embryos detected by W estern blot
2.5 cdx1b可能是pma-m iR-200c-3p的一个靶
基因
本研究中通过TargetScan和Microcosm Targets软件分析发现，cdx1b 3′-UTR的一段序列与pmamiR-200c-3p的种子序列除了第4个位点不能互补外，其他位点完全互补（图5-A）。由此推测，cdx1b可能是pma-miR-200c-3p的一个靶基因。
在体外，将cdx1b 3′-UTR连到pEGFP-C2载体上（图5-B），转染HEK-293T细胞后，发现与NC共转的细胞，荧光强度和只转染EGFP 3′-UTR的WT差异不大，而共转了pma-miR-200c-3p的细胞和NC、WT相比，其荧光强度明显减少（图5-C）。Western blot检测结果显示，EGFP cdx1b 3′-UTR和NC共转的细胞，GFP的表达量与只转染EGFP 3′-UTR细胞的一致，而共转pma-miR-200c-3p的细胞，GFP表达量减少（图5-D）。这说明pma-miR-200c-3p可能与cdx1b 3′-UTR结合，抑制了EGFP的表达。这也提示，cdx1b可能是pma-miR-200c-3p的一个靶基因。同时，qRTPCR结果显示，与WT和NC相比，过表达pmamiR-200c-3p的斑马鱼胚胎中cdx1b表达量极其显著下降（P＜0.001）（图5-E），即pma-miR-200c-3p的过表达抑制了斑马鱼cdx1b基因的表达。
图5 斑马鱼cdx1b可能是pma-m iR-200c-3p的一个靶基因
Fig.5 Zebrafish cdx1b may be a target gene of pmam iR-200c-3p
注：A为pma-miR-200c-3p和cdx1b的结合位点；B为pEGFP-C2-cdx1b 3′-UTR载体的构建；C为转染细胞的荧光比较（标尺500μm）；D为用Western blot法检测出的293T细胞中GFP的表达量；E为用qRT-PCR法检测出的斑马鱼胚胎中cdx1b的表达水平
Note：A，the binding site between pma-miR-200c-3p and cdx1b；B，plasmid construction of pEGFP-C2-cdx1b3′-UTR；C，the GFP fluorescence comparison of transfecting 293T cell，bar=500μm；D，Western blot analysiswas performed to quantify the expression of EGFP；E，the relative expression of cdx1b in zebrafish was detected by qRT-PCR
Auman等［2］研究表明，心脏的发育伴随着心肌细胞大小的改变以及形状的变化。本研究中通过在斑马鱼Ⅰ细胞期动物极注射pma-miR-200c-3p mimics，使之过表达，发现斑马鱼的心脏尤其是心房增大，推测pma-miR-200c-3p可能在心脏发育过程中发挥着重要的调控作用。
心脏的发育是一个复杂的过程，受到不同的转录调控因子、心脏特异的转录因子和许多信号通路的调控［5］。已有研究表明，Notch通路可通过参与上皮-间叶细胞转化（EMT）来促进心瓣的形成。notch1a和tbx2b、bmp4分别参与了心内膜的形成以及心肌细胞的分裂分化、心肌细胞的迁移，心脏的发育也离不开bmp5、smad1、gata5等转录因子的参与。因此，本研究中检测了这些心脏相关标志性基因的表达。结果发现，在过表达pma-miR-200c-3p的斑马鱼中，这些基因的表达量都显著上升（图3），说明pma-miR-200c-3p可能参与心脏的发育过程。
Van Wijk等［24］研究表明，BMP4/5、Smad1和GATA5属于BMP/Smad信号通路。在心脏发育过程中，BMP家族及其下游SMAD家族参与心脏祖细胞的分化、增殖等过程。BMP家族通过Ⅰ型和Ⅱ型受体激酶使得Smad1/5/8磷酸化［25］，磷酸化的Smad1/5/8和Smad4进入细胞核，促进靶基因Nkx2.5、GATA家族这些靶基因的激活，从而促进心肌祖细胞的分化［26-27］。Lee等［28］研究表明，心脏祖细胞中GATA4/5/6的表达需要BMP-Smad1/4的参与，并且在鸡轴旁中胚层中，发现BMP能够诱导GATA4/5/6的表达。本研究中采用Western blot技术检测了斑马鱼胚胎中BMP4、Smad1和GATA5的表达水平，结果发现，与对照组WT和NC斑马鱼相比，注射了miR-200c-3p斑马鱼的BMP4、Smad1和GATA5表达量明显增加（图4），GATA5是心脏形成以及心脏祖细胞分化的重要转录因子［29］。说明pma-miR-200c-3p可能通过调控BMP/Smad通路来促进心脏的分裂分化。
cdx家族是胚胎形成过程中重要的转录调控因子，参与心脏、肾脏、肠的形成以及造血细胞的分化等［30］。Lengerke等［9］研究表明，在小鼠胚胎干细胞中过表达cdx1会抑制心脏的发育，而在cdx1基因突变的斑马鱼胚胎中，前外侧板中胚层tbx5a的表达量升高，而前外侧板中胚层会发育成心脏祖细胞。本研究中，通过TargetScan、Microcosm Targets等软件预测，发现cdx1b可能是pma-miR-200c-3p的一个靶基因（图5-A）。为验证cdx1b是否为pma-miR-200c-3p的靶基因，本研究中将cdx1b的3′-UTR克隆到pEGFP-C2质粒上，转染293T细胞，结果发现，过表达miR-200c-3p后，293T细胞荧光减少，并且在蛋白水平上检测发现，GFP表达量降低（图5-D）。为进一步验证pmamiR-200c-3p是否能够抑制cdx1b的表达，用qRT-PCR技术检测了斑马鱼中cdx1b在mRNA水平的表达，发现其表达量降低（图5-E）。这表明，pma-miR-200c-3p可能通过抑制cdx1b来促进心脏的发育。
由此推测，海七鳃鳗胚胎中高表达的pmamiR-200c-3p可能通过抑制cdx1b的表达，以及上调BMP通路中某些重要基因的表达来调控心脏的发育。需要指出的是，本试验中对pma-miR-200c-3p的功能研究都是在斑马鱼细胞水平上进行验证的，这可能与pma-miR-200c-3p在海七鳃鳗体内对心脏发生的影响有所差异。后续工作中需尽可能找到海七鳃鳗pma-miR-200c-3p自身的靶基因来研究其调控机制，并且在海七鳃鳗体内验证相关基因的表达功能，从而进一步揭示pma-miR-200c-3p对心脏发育调控的分子机制。
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Functional effects of pma-m iR-200c-3p of sea lam prey on heart development of zebrafish
Abstract：The pma-miR-200c-3p mimics from sea lamprey Petromyzon marinus were injected into zebrafish Danio rerio embryos bymicroinjection，and qRT-PCR and Western blotwere used to analyze themarker gene expression of the development of heart，and the expression levels of several genes in BMP/Smad pathway to study the biological function of pma-miR-200c-3p of the sea lamprey.Besides，target gene bio-informatics and GFP fluorescence expression analysiswere used to study the function of pma-miR-200c-3p.The results showed that the gene expression levels of some cardiac developmentmarkers including bmp4，bmp5，smad1，gata5，tbx2b and notch1a were significantly increased in the pma-miR-200c-3p-injected embryos（P＜0.01）.The protein expression levels of the BMP4，Smad1 and GATA5 were significantly increased bya BMP/Smad pathway，and it appears that cdx1b is a targetgene of pma-miR-200c-3p.Therefore，the findings indicate that pma-miR-200c-3pmight repress the gene expression of cdx1b，and be involved in the BMP/Smadpathway to promote the cardiac development process. Key words：Petromyzon marinus；miR-200c-3p；zebrafish；cardiac development；cdx1b
中图分类号：Q951
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.05.007
文章编号：2095-1388（2016）05-0510-06
收稿日期：2015-12-17
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31572598）；上海市教育发展基金会和上海市教育委员会曙光计划项目（13SG51）；教育部科学技术研究项目（213013A）；上海市教委水产学高峰学科项目