摘要：为研究大蒜素在鱼体内的吸收、消除规律，以7.5 mg/kg（体质量）单剂量口灌给药后，探究大蒜素在松浦镜鲤Cyprinus carpio Songpu体内的药物代谢动力学及药物残留消除规律。试验水温为（20.0± 0.5）℃，试验鲤体质量为（1.3±0.2）kg，在给药后0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00、36.00、48.00、72.00 h采集鲤的血浆，用气相色谱法测定鲤血浆中药物的浓度，并用药动学DAS 3.0软件进行数据分析和处理。结果表明：单次口灌给药后，大蒜素在血浆中的药时关系符合一级吸收二室开放模型；每天一次连续3 d给药后，大蒜素的主要成分二烯丙基二硫化物（DADS）和二烯丙基三硫化物（DATS）均于第15天开始低于10μg/kg。研究表明，在本试验条件下，建议休药期不低于15 d。
关键词：松浦镜鲤；大蒜素；药动学；药物残留
由中国水产科学研究院黑龙江水产研究所采用混合选育的方法培育繁殖而成的优良新品种——松浦镜鲤Cyprinus carpio Songpu具有成活率高、繁殖快、增重快、肉多且鲜美等诸多优点，是中国当今淡水名优品种重点开发对象之一。
大蒜素（allicin）化学名为二烯丙基三硫化物，是大蒜的主要有效成分，有刺鼻气味，微溶于水，溶于乙醇、苯、乙醚等有机溶剂［1］。大蒜素性质不稳定，常温下极易挥发，可进一步分解生成性质稳定的二烯丙基二硫化物（DADS）、二烯丙基硫化物（DAS）、阿霍烯（ajoene）和少量的二烯丙基三硫化物（DATS，即大蒜素）等［2］。大蒜素对多数细菌有抑制作用，药效良好，对革兰氏细菌、真菌均有显著的抑制作用［3］，对有益菌如大肠杆菌则无抑制作用，大蒜素无毒副作用，不会产生药物残留，且不会导致细菌产生耐药性，是抗生素的首选替代药物［4］。
目前，在水产养殖中对大蒜素作为添加剂的研究较多。陈欣然等［5］对鲤、唐玲等［6］对镜鲤、吕富等［7］对银鲫、聂乾忠［8］对草鱼和王常安等［9］对哲罗鲑的研究表明，饲料中添加适量大蒜素可显著提高鱼的摄食量与生长速度。有关大蒜素的抗菌作用也有诸多报道，李婵等［10］研究表明，在虹鳟饲料中添加15 mg/kg的大蒜素，能显著提高虹鳟肾脏中碱性磷酸酶的活力；时威等［4］研究表明，大蒜素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌作用；宋文华等［11］研究表明，饲料中添加0.4％、0.8％大蒜素组的草鱼血清超氧化物岐化酶活性高于对照组。但尚未见关于大蒜素在鱼体内的药动学及残留的研究报道，故本研究中就此进行了研究，计算其有关药动学参数，旨在为大蒜素在鲤养殖中鱼病的防治以及科学、合理使用提供理论依据。
1.1 材料
1.1.1 试验鱼 试验鲤由黑龙江水产研究所呼兰试验基地提供，体质量为（1.3±0.2）kg。试验鱼在自动循环水族缸中暂养驯化3 d，驯化期间正常喂养，给药前停饲24 h。试验在室内进行，试验期间不投喂，水温保持恒定（20℃±0.5℃），正常供氧，水体溶氧为6.00 mg/L以上。
1.1.2 试验药品 DADS标准品含量94.2％，由中国食品药品检定研究院提供；DATS标准品含量75％，由上海安普CNW提供。二氯甲烷（A.R）、正己烷（GC）均为市售分析纯。
1.1.3 试验仪器 安捷伦7890B气相色谱仪（Agilent仪器公司）；3-18K高速离心机（Sigma公司）；HYQ-3110调速混匀器（深圳市宝域科技有限公司）；SB5002电子天平（上表电子仪器厂）；DCY-24A氮吹仪（上海精密仪器仪表有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 给药剂量及样品的采集
（1）药动学试验。以7.5 mg/kg（体质量）的给药剂量对鲤单次口灌大蒜素，对18尾鱼给药，随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组6尾鱼。单次口灌大蒜素后，采用活体多次体侧取血法［12］，各剂量组取样方案为，Ⅰ组分别于给药后0.25、1、4、12、48 h，Ⅱ组分别于0.5、1.5、6、24、72 h，Ⅲ组分别于0.75、2、8、36 h，从试验鱼尾部采集血液1 mL（注射器事先用0.3％肝素钠润洗），每次采样前后均用体积分数为75％的酒精棉球于进针部位进行消毒，并在采样后按压针孔部位以止血。将血液样品以4000 r/min离心10 min后，取上层血浆于冰箱（-20℃）中保存备用。
（2）残留试验。以有效成分为7.5 mg/kg（体质量）的剂量，每天一次，连续3 d对松浦镜鲤口灌大蒜素溶液（食用油配制），停药当天为第1天，于第1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15、17、21、25、30天每天随机选取6尾试验鱼，采集其肌肉组织，保存于冰箱（-20℃）中备用。
1.2.2 样品的前处理
（1）血浆样品。将采集的血浆从冰箱中取出，4℃下自然解冻后摇匀，取0.5 mL血浆，加入0.5 mL正己烷涡旋0.5 min，以3000 r/min离心5 min，过0.22μm有机滤膜上机待测。
（2）肌肉样品。将肌肉从冰箱中取出室温下化冻，称重后放入50 mL平底离心管中，加入4 mL二氯甲烷浸没肌肉匀浆，匀浆机刀头用3 mL二氯甲烷清洗，合并两次提取液，漩涡混匀，用离心机高速离心5 min后吸取上清液。按上述步骤将残渣重新提取两次。将最后提取液于通风厨内在30℃下用吹氮仪吹干，管底残渣加入1 mL流动相震荡至完全溶解，再加入1 mL正己烷去除油脂，震荡后离心，吸取底层溶液过0.22μm有机相滤膜，吸取1 mL转入样品瓶上机待测。
1.2.3 气相色谱条件 色谱柱为Agilent 7890B HP-5柱（30 m×320μm×0.25μm）；检测器为火焰光度检测器FPD（S），检测器温度为200℃；进样量为1μL，不分流进样，进样口温度为160℃；载气为高纯氮气，恒流模式，2 mL/min。
1.2.4 标准曲线的绘制 用正己烷将DATS、DADS标准品稀释成浓度为25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 ng/mL的混合标准工作液，精确吸取1μL注入气相色谱仪，以检测峰面积为y坐标轴、大蒜素质量浓度为x坐标轴绘制标准曲线，分别求出DADS、DATS的回归方程和相关系数。
1.2.5 回收率的测定 取空白血浆0.5 mL，添加100、500、1000 ng/mL的混合标准液，添加标准液后的总体积为1mL，设3个平行组，于4℃下静置过夜，使药物充分渗入组织中，按上述处理方法处理后，与样品一起上机检测。按照下式进行计算：
1.2.6 精密度的测定 一天内不同时间重复测定3次，一周内不同时间重复测定3次，计算出样品在不同浓度下的相对标准偏差，计算出日内精密度和日间精密度。
1.3 数据处理
标准曲线由气相色谱检测报告所得，药-时曲线与药动学模型拟合及参数计算均由DAS 3.0软件处理。
2.1 标准曲线及其检测限
根据建立的气相色谱检测方法，测得DADS和DATS的最低检测限均为10 ng/mL。以两者的质量浓度为横坐标x，以测得的峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线。回归方程分别为
2.2 标准品与样品的色谱图
由本试验所应用的检测方法得到DADS、DATS标准品色谱图中两者的出峰时间分别为3.7 min和5.2min左右。与标准品色谱图对比后发现，样品中DADS、DATS的色谱峰和出峰时间与标准品一致。
2.3 回收率与精密度
本试验条件下，混合标准液在鲤血浆与肌肉中的回收率分别为91％～97％、96％～99％。鲤血浆、肌肉的日内精密度分别为0.38％±0.053％和0.40％±0.060％，日间精密度分别为0.28％± 0.069％和0.45％±0.077％。
2.4 大蒜素在鲤血浆的药时曲线与主要药动学参数
DADS、DATS在鲤血浆中药动学特征符合一级吸收二室开放模型，其代谢方程分别为
主要药动学参数如表1所示。图1为（20± 0.5）℃时以7.5 mg/kg（体质量）药量给鲤单次口灌大蒜素后，鲤血浆的药物浓度随时间的变化规律。
图1 鲤血浆中DADS、DATS浓度随时间的变化
Fig.1 Concentrations of DADS and DATS in the plasma of Songpu m irror carp Cyprinus carpio Songpu at various time
表1 鲤血浆中DADS和DATS的药代学参数
Tab.1 Pharmacokinetic parameters of DADS and DATS in plasma of Songpu m irror carp Cyprinus carpio Songpu
参数分布相的零时截距A/（μg·L-1）27.02 26.72分布速率常数α/h-10.14 0.23消除相的零时截距B/（μg·L-1）0.001 0.001消除速率常数β/h-10.050 0.0025药物吸收速率常数ka/h-127.02 173.87延滞时间TL/h-10.00 0.00分布相半衰期T1/2α/h-13.72 3.00消除相半衰期T1/2β/h-1213.43 343.14吸收相半衰期T1/2ka/h-10.08 0.54药物自周边室到中央室的一级转运速率K21/h-10.04 0.00药物自中央室的消除速率K10/h-10.59 0.12药物自中央室到周边室的一级转运速率K12/h-10.03 0.11 209.05 213.71药时曲线下总面积AUC/（μg·L-1·h-1）327.81 442.80体积内总消除率CL（s）/（L·kg-1·h-1）24.36 16.01达峰时间Tmax/h 0.15 0.87峰浓度Cmax/（μg·L-1）26.91 27.61表观分布容积V/F（c）/（L·kg-1）parameter DADS DATS
表2 松浦镜鲤肌肉中DADS和DATS的残留浓度
Tab.2 Residual concentrations of DADS and DATS in muscle of Songpu m irror carp Cyprinus carpio Songpu
采样时间/d time DADS浓度/（ng·g-1）DADS concentration DATS浓度/（ng·g-1）DATS concentration 33.416 20.728 2 41.415 31.335 3 71.275 52.930 4 39.355 75.245 5 30.425 58.192 6 25.981 31.650 7 16.861 23.803 9 13.947 20.498 11 14.265 13.930 13 11.085 14.040 15——17——21——25——30 1——
2.5 松浦镜鲤体内药残留的消除规律
给药后各采样时间点，DADS和DATS在肌肉组织中的含量如表2所示，在停止给药的第5天，DADS在鲤肌肉中的含量仍然较高（30.425 ng/g），而DATS在松浦镜鲤体内的达峰时间较DADS有1 d的滞后。随着停药时间的延长，DADS在松浦镜鲤体内的消除要快于DATS，停药后检测到的DADS含量高于DATS含量，但在停药4 d后DADS含量明显低于DATS含量，但DATS在镜鲤肌肉内消除较快。而DADS在肌肉中的含量降到16.861 ng/g后，消除开始极其缓慢。经吸收代谢后，DATS在肌肉中的残余量在停药后第15天开始低于10 ng/g。
3.1 大蒜素在松浦镜鲤体内的药动学特征
相关研究表明，表观分布容积V/F（c）值大于1.0 L/kg时，说明药物广泛分布于机体内。由本试验结果可知，DADS和DATS的V/F（c）值分别为209.05、213.71 L/kg，表明DADS和DATS在鲤体内均广泛分布。比较DADS和DATS的分布相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β可以发现，DADS比DATS吸收快，但是消除极其缓慢。以7.5 mg/kg（体质量）的剂量单次口灌大蒜素0.25 h后，DADS和DATS在鲤血浆中的浓度分别为18.74、16.70μg/L，血浆中DADS含量高于DATS，与大蒜素药品中两者含量对比相符。在鲤体内DADS和DATS的含量随着时间的推移逐渐升高，并分别在8、6 h达到峰浓度，峰浓度分别为30.97、26.56 ng/mL。相同给药剂量下，DADS和DATS在鲤体内达峰时间的不同也说明了不同成分对药物的代谢动力学特征有很大的影响，这种现象在史氏鲟［13］、镜鲤［14］、鲫［15］、草鱼［16］、虹鳟［17］、斑点叉尾鮰［18］、大菱鲆［19］中得到了大量的药代动力学试验验证。
本试验中，由药-时曲线（图1）可以看出，DADS在鲤血浆中有双峰出现。魏凤环等［20］研究表明，体内药物吸收出现的双峰现象是由于肝-肠二次吸收和胃肠道的多部位吸收而引起的，而肝-肠二次吸收则被认为是产生双峰现象最有可能的一种机制，而且若存在肠-肝的二次吸收，则第二次药物峰的药物面积是要低于第一峰的药物面积［21-22］。本试验中，DADS在鲤血浆中第二峰浓度低于第一峰，因此，推测DADS在鲤血浆中出现的双峰现象可以认定为肝-肠循环。本试验中大蒜素在鲤血浆中的药物代谢动力学与其他常规药物不同，其吸收分布机制有待进一步研究。
3.2 大蒜素在松浦镜鲤体内的药残
入口食用食品中药残的检测，通常只选用食用组织，中国农业行业标准NY5070-2002《无公害食品水产品中渔药残留限量》关于鱼类药残选取的是肌肉和皮［12］。考虑到大蒜素的可食性及本身易吸收代谢的特性，本研究中只选取肌肉组织进行大蒜素在鲤体内残留消除规律的研究。
在（20±0.5）℃水温条件下，以实际含量为7.5 mg/kg（体质量）的药物剂量，每天一次，连续3 d对松浦镜鲤口灌大蒜素后，DADS和DATS在停药后第4、5天均出现了明显的下降趋势。停药后，DADS在肌肉中的残留量明显小于DATS，且停药后DADS消除速度较DATS快。说明DADS在鲤体内较DATS吸收快但消除缓慢。
大蒜素有诱食、增食［23］抗病毒等多种生物学功能，因此，目前大蒜素主要用于饲料添加剂［24-25］或用于抗菌［3，26-27］，对大蒜素在鱼体内的药物代谢动力学研究较少，其具体吸收代谢机制尚不明确，有待于进一步研究。考虑到大蒜素的药用价值与可食性，建议休药期为15 d（鉴于温度对鱼体内药物代谢的影响［3，16］，若休药期温度高于20℃时，建议休药期仍为15 d，若温度低于20℃时，则建议适当延长休药期），或在与其他药物一同使用杀菌治疗鱼病时，可以以其他药物的代谢期为标准制定休药期。
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Pharmacokinetics and residues of allicin in Songpu m irror carp Cyprinus carpio Songpu
Abstract：The pharmacokinetics and residues of allicin were studied in Songpumirror carp Cyprinus carpio Songpu exposed to oral administration at a dose of 7.5 mg/kg（body weight）at water temperature of（20.0±0.5）℃by means of gas chromatography（GC）.The drug concentrations in plasma weremonitored 0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，2.00，4.00，6.00，8.00，12.00，24.00，36.00，48.00 h，and 72.00 h after drug administration，and analyzed by DAS 3.0 software.The results showed that the concentrations of allicin in muscle versus time were well described by two-department openmodelwith first-order absorption after a single oral administration.The residues in Songpu mirror carp by oral administration for 3 d once a day was found to be less than the maximal residue limit（MRL）（10μg/kg）at the day 15 for DADS and DATS.The findings indicate that the withdrawal time should be 15 d after administration under these conditions.
Key words：Cyprinus carpio Songpu；allicin；pharmacokinetics；residue
中图分类号：S948
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.05.006
文章编号：2095-1388（2016）05-0505-05
收稿日期：2015-12-25
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201203085）；渔药使用风险评估及其控制技术研究与示范项目；现代农业产业技术体系建设专项（CARS-46）