-N） 为0.026 mg/L，氨氮 （
-N）为0.03 mg/L，溶解氧 （DO）为7.55 mg/L，化学耗氧量 （CO
）为2.2 mg/L，生物滤池和养殖池连续曝气。将生物填料均匀布置在生物滤池中 （M3用细绳均匀悬挂在生物滤池中），挂膜期间水体缓慢循环流动，待生物膜成熟后，将水流速度调整到正常值 （7.5 L/min），每天9：00正常投喂。摘要：为研究生物填料上生物膜的细菌群落组成及其在循环水养殖系统中的应用，选择3种生物填料构建生物滤池，采用细菌16S rRNA基因片段扩增和Illumina高通量测序法，分析了循环水养殖系统中填料上生物膜和对应生物滤池水体中的细菌群落种类组成。结果表明：3种生物填料均有富集微生物生长的作用，生物填料上生物膜的细菌种类和多样性大于对应的生物滤池水体；在门分类水平，3个生物滤池水体中的优势菌相同，均为厚壁菌门，3种生物填料上生物膜的优势菌不尽相同，聚乙烯小球生物膜的优势菌为厚壁菌门，陶瓷环和弹性毛刷生物膜的优势菌为变形菌门；弹性毛刷生物膜的细菌种类最多、多样性指数最高，由变形菌门的26个属细菌组成，聚乙烯小球生物膜的细菌种类组成最少、多样性指数最低，由厚壁菌门的23个属组成，细菌丰度指数最低。
关键词：循环水养殖系统；生物膜；细菌群落；生物滤池
循环水养殖具有节水、节地、环保等优点，是未来水产养殖方式的发展方向。水处理是循环水养殖系统的核心单元，生物膜法处理养殖水体已经在循环水养殖中有了较多的应用，而生物膜上附着的细菌是降解水体污染物的主要承担者，在水质净化方面发挥着重要作用［1-3］。国内外许多学者在生物膜的快速挂膜、细菌群落组成、细菌群落多样性等方面进行了研究，并取得了一定成果［4-8］。
利用16S rDNA克隆文库法分析细菌群落结构已有较多报道［9-11］，随着第三代高通量测序技术的发展，克隆方法不需要进行细菌的纯培养就可以进行高通量测序，利用所得序列信息比较不同样品中的微生物丰度及多样性情况［12］。生物膜载体是生物膜法处理养殖尾水的核心部分，在水体净化过程中发挥着重要的作用。本研究中，以生产应用中常见的3种生物填料为对象，通过室内模拟构建循环水养殖系统，以自然挂膜方式培养生物膜，采用细菌通用引物扩增16S rRNA基因，应用Illumina高通量测序法，对3种填料上生物膜以及对应生物滤池水体的微生物群落种类组成进行了分析，以期为养殖生产过程中生物膜载体材料的应用和选择提供参考，为循环水养殖系统中生物滤池的净化效率及生物膜的作用机理提供理论依据。
1.1 材料
生物填料分别为聚乙烯小球、陶瓷环、弹性毛刷。罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii购自湖州市城南农贸市场，体质量为 （28.4±0.89）g。
1.2 方法
1.2.1 养殖系统 试验在浙江省淡水水产研究所养殖基地进行。循环水养殖系统由养殖池、沉淀池、生物滤池3部分构成，在沉淀池和生物滤池内各安装一个小型水泵构成内循环。养殖池、沉淀池、生物滤池分别由有效体积为150、120、100 L 的PVC水族箱构成，生物滤池内依次放置不同类型的生物填料，养殖池内放网片。罗氏沼虾放养密度为40只/箱。1.2.2 样品的采集 聚乙烯小球、陶瓷环、弹性毛刷填料上的生物膜样本编号分别为 M1、M2、M3，3种生物填料对应的生物滤池水体样本编号分别为W1、W2、W3。待生物膜成熟后，用无菌方式取100 mL生物滤池水样和部分生物填料于灭菌玻璃瓶中带回实验室，每个样本采集2次。用灭菌手术刀将载体上的生物膜刮下，剧烈震荡以使载体上的生物膜溶解，水样和生物膜悬浮液经灭菌滤膜（孔径为 0.22 μm）过滤后，将滤膜放入冰箱（-20℃）中保存备用。
1.2.3 试验设计 试验水温为 （24±1）℃，将外塘养殖水泵放入生物滤池内，初始水质指标如下：pH值为7.4，总氮 （TN）为 3.62 mg/L，总磷（TP）为 0.084 mg/L，亚硝酸盐 （-N） 为0.026 mg/L，氨氮 （-N）为0.03 mg/L，溶解氧 （DO）为7.55 mg/L，化学耗氧量 （CO）为2.2 mg/L，生物滤池和养殖池连续曝气。将生物填料均匀布置在生物滤池中 （M3用细绳均匀悬挂在生物滤池中），挂膜期间水体缓慢循环流动，待生物膜成熟后，将水流速度调整到正常值 （7.5 L/min），每天9：00正常投喂。
1.2.4 样品DNA提取及PCR扩增 将滤膜解冻后剪碎，参照 DNA提取试剂盒 E.Z.N.A.Water DNA Kit（Omega Biotech，美国）方法提取细菌基因组DNA。采用细菌通用引物515F（5′GTGCCAGCM GCCGCGG 3′）和 907R（5′CCGTCAA TTCMTTTRAGTTT 3′）进行扩增 （上海美吉生物公司合成）。
PCR扩增体系 （共20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物各0.8 μL（5 μmol/L），FastPfu Polymerase 0.4 μL，DNA模版10 ng，用灭菌超纯水补足至20 μL。PCR反应在ABI GeneAmpⓇ9700扩增仪上进行 （美国ABI公司）。PCR反应条件：95℃下预变性3 min；95℃下变性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸45 s，共进行28个循环；最后在72℃下再延伸10 min。
1.2.5 高通量测序分析 PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 （美国AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统（美国Promega公司）检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合，构建基因文库，最后由上海美吉生物公司进行测序。
1.3 数据处理
为了便于分析，对获得的序列进行归类操作，用MOTHUR 1.30.1软件将97%相似水平下的序列归为一个操作分类单元 （Operational Taxonomic U-nits，OTU），之后对每个样本的Shannon多样性指数、Chao1丰度指数、Coverage测序深度指数进行生物信息统计。
使用 NCBI的 BLAST检索系统 （http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）对得到的序列进行同源性分析，用CLUSTER软件进行聚类分析，用Heatmap Illustrator 1.0.1软件制作Heatmap图。
2.1 测序数据的合理性
采用细菌引物515F和907R对16S rDNA进行扩增，扩增结果见图1。扩增产物为单一条带，片段大小约400 bp，符合引物设计的长度。Miseq测序得到的是双端序列数据，经过质控、去杂、拼接、校正，同时去掉质量较低序列和嵌合体后得到有效序列，保证了测序数据的合理性。
本研究中共获得174 988条有效序列，在97%的相似水平下，样品被均一化为 275～660个OTUs。聚类分析结果表明，每个处理的两个平行样本聚集在一起，为同一个分支，距离最近，说明获得的序列是可重复的，也是可靠的 （图2）。
图1 生物膜及水样中细菌基因组PCR扩增图
Fig.1 PCR amplification profile of bacterial genome on bio-film and in water samples
图2 基于OTU水平的12个样本聚类图
Fig.2 Hierarchical clustering result of communities at OTU level in the twelve samples
2.2 微生物群落组成分析
图3为门分类水平的细菌群落组成。在可鉴别的细菌中，生物填料上生物膜的细菌种类大于对应水体中的细菌种类。M2生物膜上的细菌分属于16个门，M3分属于15个门，M1分属于14个门；在生物滤池水样中，W1的细菌种类最多，有13个门，其次为W3，有12个门，W2最少，有7个门。M1的优势菌为厚壁菌门Firmicutes，占细菌种类总数的61.62%，M2和M3上的优势菌为变形杆菌门Proteobacteria，分别占细菌总数的32.30%和34.78%；W1、W2和W3中的优势菌相同，均属于厚壁菌门 Firmicutes，分别占门分类总数的52.27%、85.49%、37.14%。
纲分类水平的细菌种类所占百分比见表1。W2和W3中的优势菌为芽孢杆菌纲Bacilli，分别占细菌总数的86.67%和37.54%，W1的优势菌为鞘脂杆菌纲 Sphingobacteriia，占细菌总数的22.54%。生物膜上的优势菌各不相同，M1的优势菌为β-变形菌纲β-Proteobacteria，占细菌总数的64.29%，M2的优势菌为蓝细菌纲Cyanobacteria，占细菌总数17.69%，M3中的优势菌为鞘脂杆菌纲Sphingobacteriia，占细菌总数的25.04%。
图3 生物膜上主要细菌分类组成 （门水平）
Fig.3 Percentages of the major phyla of bacteria on bio-film in each treatment
表1 生物膜及水体中主要细菌分类组成 （纲水平）
Tab.1 Percentages of the major bacterial classes on bio-film and in water samples %
class W1 W2 W3 M1 M2 M3酸杆菌纲类别Acidobacteria 1.71 0.03 0.23 0.69 6.85 8.47放线菌Actinobacteria 8.86 9.03 18.39 0.16 0.76 0.56 α-变形菌α-Proteobacteria 11.98 1.93 8.60 1.70 8.91 11.49芽孢杆菌Bacilli 20.93 86.67 37.54 0.45 0.69 0.53 β-变形菌β-Proteobacteria 6.35 0.78 1.91 64.29 8.29 13.56蓝细菌Cyanobacteria 2.05 0.04 9.42 4.62 17.69 5.83拟杆菌Bacteroides 1.79 0 1.35 8.57 13.83 1.42 δ-变形菌δ-Proteobacteria 1.23 0.04 0.79 0.39 2.28 1.12黄杆菌Flavobacteriia 3.51 0.06 0.32 8.37 0.69 0.75 γ-变形菌γ-Proteobacteria 7.50 0.97 3.08 6.46 10.67 8.58浮霉菌Planctomycetacia 5.32 0.15 0.52 1.10 9.55 7.59鞘脂杆菌Sphingobacteriia 22.54 0.05 13.01 1.78 7.83 25.04少数的minor 3.85 0.17 3.73 0.86 5.73 12.63未鉴别unclassified 2.38 0.10 1.14 0.65 5.83 2.43
图4为3种填料的生物膜及其对应生物滤池水体中的细菌在属水平所占比例图。为避免数值差异过大及负数的产生，每个OTU所占百分比数值经处理后绘制成Heatmap图。生物膜及水样中的细菌共分属27个可以鉴别的属，占所有属序列的79.41%，有20.59%的序列属于无法鉴别或未培养的细菌。M1中的优势菌为黄杆菌属Flavobacterium，占细菌总数的7.85%；M2中的优势菌为硝化螺旋菌属Nitrospira，占细菌总数的5.80%；M3中的优势细菌为红环菌科的Sulfuritalea，占细菌总数的2.85%。3个生物滤池优势菌相同，为肠球菌属Enterococcus，分 别 占 细 菌 总 数 的 17.92%、73.94%、32.22%。
图4 生物膜及水体中细菌主要属所占比例图
Fig.4 Percent architecture heatmap of the major bacterial genera on each bio-film and in water samples
2.3 细菌群落组成多样性分析
生物膜及水样中细菌的丰度指数及多样性指数见表2。本研究中，样本测序数在9043～15 227之间，从Chao1丰度指数和Shannon多样性指数分析，生物膜的细菌丰度指数及多样性指数均高于水体样本。其中，M3的Chao1丰度指数和Shannon多样性指数最高，分别为690.3和5.39，其次为M2，M1的细菌丰度指数和多样性指数在3种填料中最低。对应的生物滤池水体中，W2的细菌丰度指数和多样性指数较高，其次为W1，W3最低。各样本的测序深度指数Coverage均大于98%，表明各样本文库覆盖率较高，代表了样本中微生物的真实情况 （表2）。
表2 生物膜和水样中细菌的丰度指数及多样性指数 （α= 0.03）
Tab.2 Richness and diversity index of the bacteria on biofilm and in water samples（α=0.03）
样品编号sample No.序列数number sampled丰度指数Chao1 index多样性指数Shannon index测序深度指数Coverage index W1 15227 242.0 1.42 0.99 W2 10528 262.0 1.68 0.99 W3 10018 120.3 1.21 0.99 M1 11687 388.6 2.62 0.99 M2 9043 538.1 4.59 0.98 M3 11127 690.3 5.39 0.99
3.1 第三代高通量测序法的优点
随着分子生物学的发展，第三代高通量测序方法已经用于环境微生物群落组成分析，越来越多的研究人员利用高通量测序平台，对环境微生物的群落组成、细菌多样性等方面进行了深入地研究［13-20］。传统的微生物检测方法基于可培养或可鉴别的细菌种类，对于样本来源复杂、细菌含量较低、未培养等细菌不能有效检测出。与传统的分子生物学方法 （PCR-DGGE）相比，第三代高通量测序法能更全面、更客观地反映环境样本的微生物组成，尤其对含量较少的微生物群落，也能完全检测出［21-23］。对高通量测序而言，测序的数量和深度直接影响测序结果，对所得序列能否全面反映样本的真实情况有很大的影响。稀释性曲线是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线［24］。本研究中，采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所代表OTU的数目构建稀释性曲线，图5中各样本曲线随着测序深度的加深趋于平坦，说明更多的测序量只会产生少量新的OTU，表明目前的测序数据量合理。
图5 样本的稀释性曲线图 （相似水平为0.97）
Fig.5 Rarefaction curve of bio-film and water samples （label 0.97）
3.2 生物填料中优势菌的种类及其与水体净化作用的关系
本研究结果表明，生物填料有富集水体细菌的能力，其生物膜上的细菌种类和丰度远大于对应水体，且水体中的优势菌和生物膜上的优势菌并不相同，如水体中的优势菌为肠球菌属Enterococcu，而生物膜上的优势菌为黄杆菌属Flavobacterium、硝化螺旋菌属Nitrospira等 （图4）。原因可能是：本试验中养殖用水为外塘自然水体，含有多种分别具有不同生理功能的细菌，而生物填料为生物膜的培养提供了可附着的栖息条件，水体中一部分细菌会逐渐附着其上，形成生物膜上的优势菌。不同类型生物填料的内部结构及其物理性质不同，为微生物生长富集创造的环境条件也不同，生物膜载体对附着的细菌种类具有选择性，水体中细菌只有一部分能附着于载体上，故水体中的优势菌并不一定能成为生物膜上的优势菌［24］。微生物是生物膜的主要组成部分，在微生物的生化代谢过程中，水体中的氨氮、亚硝酸盐等营养盐可以被其分解利用，导致水体中污染物浓度水平发生变化。当水体中的污染物浓度、温度、碳氮比、气水比等因素发生变化时，也会影响生物膜上的细菌组成，导致水体和生物膜中的优势菌不同［25］。
硝化细菌可以将水体中的亚硝酸盐氧化为硝酸盐，是降解水体亚硝酸盐的重要途径，在氮循环水质净化过程中起重要作用。硝化螺旋菌Nitrospira作为硝化细菌的一个属，已经在不同的污水处理厂和实验室反应器中被发现，并被认为是对含氮污染物的去除起重要作用的菌群［26-27］。在陶瓷环填料的生物膜中，硝化螺旋菌Nitrospira是属水平可鉴别细菌中的优势菌，占细菌总数的5.80%，高于其他处理组，这与水质检测结果2号生物滤池对亚硝酸盐去除率最高一致 （结果待报道）。
有研究指出，细菌群落组成中一些不能鉴别或未培养的细菌，可能在污染物去除过程中发挥重要的作用［28］。本研究中，在属水平出现了大量不能鉴别或未培养的细菌 （图4），这些未知细菌的功能有待深入研究。在相同的处理条件下，本研究中的弹性毛刷填料生物膜上的细菌种类最多，多样性最高，但在微生物挂膜期间，其培养时间较长，如何实现其快速稳定挂膜有待进一步研究。
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Analysis of bacterial community compositions in three biological filter media by 16S rRNA gene library
Abstract：The present study was aimed to analyze the composition of bacteria community and to evaluate the applications of biological filter media in recirculating aquaculture system.Bio-filters were constructed by three types of media and the bacterial community compositions of bio-film as well as water samples were studied using 16S rRNA gene amplification and Illumina high-throughput sequencing platform.The results showed that the three media all enriched the bacterial abundance and diversity，and that there were more bacterial species and higher biodiversity in the three media than those in the water samples.The predominant bacterial phylum was the same Firmicutes in all water samples of the three bio-filters.On the three media，however，there were different predominant bacteria in bio-film，including Firmicutes in polyethylene ball medium and Proteobacteria in submerged ceramics medium and elastic brush medium.In terms of bacterial species and diversity，the maximal value（26 genera）was observed in elastic brush medium.However，23 genera，the minimal species composition，was detected in polyethylene ball medium.
Key words：recirculating aquaculture system；bio-film；bacterial community；bio-filter
中图分类号：S959
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.04.007
文章编号：2095-1388（2016）04-0384-06
收稿日期：2015-11-27
基金项目：浙江省重点科技创新团队计划项目 （2011R50029）；浙江省重大科技专项重点农业项目 （2013C02009）