多棘海盘车柠檬酸脱毒工艺的优化研究

李 莎,张国琛,张 倩,李秀辰,牟春发

(大连海洋大学辽宁省渔业装备工程技术研究中心,辽宁大连116023)

摘要:为研究多棘海盘车Asteriasamurensis柠檬酸脱毒的最佳工艺条件,采用正交试验法进行了有关试验研究。结果表明:单因素试验中,增大柠檬酸浓度、提高脱毒温度、延长脱毒时间均可提高多棘海盘车的皂苷脱除率,但也会造成多棘海盘车蛋白质保留率显著降低 (P<0.05),增大料液比会降低多棘海盘车蛋白质保留率,当料液比为1∶10左右时,多棘海盘车的皂苷脱除率最大;在单因素试验的基础上,利用正交试验法对多棘海盘车脱毒工艺进行了优化,多棘海盘车脱毒试验中4个因素对综合评分的影响程度依次为脱毒温度>脱毒时间>料液比>柠檬酸浓度。研究表明,当柠檬酸浓度为0.10mol/L,脱毒温度为50℃,料液比为1∶8,脱毒时间为3 h时,多棘海盘车具有较好的脱毒效果和蛋白质保留率,其皂苷脱除率和蛋白质保留率分别为70.96%和91.29%,综合评分为1.982。

关键词:多棘海盘车;脱毒工艺;柠檬酸;正交试验;皂苷脱除率;蛋白质保留率

多棘海盘车Asterias amurensis又名海星、星鱼或海盘车,隶属于无脊椎动物棘皮动物门、海星纲、钳棘目、海盘车科,其生性凶残,常吞食牡蛎、扇贝、鲍鱼等海珍品,且在捕捞海产品时,常常附着在渔网上。据调查估计,仅大连沿海海域,多棘海盘车的年产量就可达5万t,严重危害着水产养殖业的发展[1]。如何有效处理多棘海盘车并实现其资源化利用,是中国水产养殖业发展面临的重大问题。多棘海盘车不仅蛋白质含量较高,氨基酸组成齐全,必需氨基酸间比例较为合理,接近优质蛋白质[2],而且含有牛磺酸、锌、甾醇、多糖等活性成分,长期摄入可促进生长发育,起到抗癌、抗菌等作用[3-4]。因此,将多棘海盘车开发为新型蛋白质饲料资源具有十分巨大的潜力。

中国已有将脱毒多棘海盘车作为蛋白质饲料添加粉饲喂动物的研究报道。徐均望等[3]研究发现,将脱毒后的多棘海盘车棘皮粉以30%的比例掺入冰冻小杂鱼中喂养牙鲆,可显著提高牙鲆的生长率、增重和成活率;以20%~30%的比例掺入国产鲍鱼饵料中喂养鲍鱼,平均增重及成活率均高于日本鲍鱼饵料组[5];金鼎等[1]研究发现,脱毒多棘海盘车粉可以作为猪饲料,并可取代部分鱼粉。在多棘海盘车资源化利用为蛋白质饲料添加剂的研究中,人们发现其体壁、胃、消化腺、生殖腺皆含有毒物质——皂苷,过量摄入会造成呕吐、头晕、昏迷甚至会死亡[3]。滕瑜等[4]研究发现,多棘海盘车毒性源于其中的毒性皂苷成分,证实其具有鱼毒作用。因此,若将多棘海盘车作为蛋白质饲料,脱除皂苷 (简称脱毒)是必要的步骤。

当前,多棘海盘车食用和饲用研究中的脱毒方法主要是酸催化水解和碱催化水解[6-7]。张成业等[8]研究发现,将多棘海盘车置于热提锅,加稀碱液分两次提取,每次加热煮沸1 h以上,合并滤液,浓缩后干燥磨粉,可制成胶囊;韩福山[9]研究发现,将多棘海盘车先后置于稀盐酸溶液和碱性皂化液中,烘干后可制作胶囊或饲料。这些方法虽然都能有效脱除多棘海盘车中的皂苷,但未考虑稀盐酸、氢氧化钠等强酸强碱会破坏多棘海盘车的营养成分和活性物质,且体内残留的酸碱会对人体有害。近年来,用有机酸溶液来脱除多棘海盘车中皂苷的探索成为一个新的研究方向[10-11]。柠檬酸是一种酸性较弱的有机酸,研究发现,在生长育肥猪日粮中添加1%~2%柠檬酸,可提高其日增重,降低料肉比,提高蛋白质消化率,降低背脂厚度,改善肉质和胴体特性。宋志乐等[11]已将用柠檬酸溶液处理后的多棘海盘车制成口服液,但脱毒工艺还亟待优化。本研究中,在单因素试验的基础上开展了多棘海盘车脱毒工艺研究,以期为多棘海盘车的增值和开发利用提供初步加工方法,实现资源的循环利用。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用多棘海盘车于2014年5月采自大连市黑石礁海域。

试验仪器:UV-7504单光束紫外-可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)、HH-8型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)、101A-5型电热鼓风烘干箱(上海试验器械公司)、雷磁pH-2F型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)、KQ3200E型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 将新鲜多棘海盘车洗净,剪取大小均匀、质量为15~20 g的多棘海盘车腕,由腕侧剖开,剥除其体内消化管、生殖腺等物质,留棘皮洗净,沥水后置于冰箱 (-20℃)中保存备用。

1.2.2 试验设计 将预处理后冷冻的多棘海盘车棘皮样品于室温下自然缓化,然后置于一定浓度的柠檬酸溶液中,以一定的温度、料液比、时间进行脱毒处理试验。最后将脱毒后的多棘海盘车沥干并用水洗净、烘干,分别测定其棘皮样品的皂苷脱除率和蛋白质保留率,综合评定脱毒效果。

1.2.3 参数的测定与计算

(1)皂苷脱除率。参考张立新等[12]多棘海盘车皂苷总含量测定方法,略有改动。精确称取样品2.5 g,用100 mL 85%乙醇浸泡,于超声清洗机中超声提取1 h,抽滤后的滤液于旋转蒸发仪上蒸干,残渣中加50 mL蒸馏水,混匀后置于分液漏斗中,用150 m L石油醚脱脂。用1 g活性炭吸附分出水层中的色素,过滤后的溶液减压蒸干后用甲醇定容至5 mL,作为待测样品溶液,重复测定两次。

取齐墩果酸标准品20 mg,用体积分数为95%的乙醇溶解并定容至 50 mL,得到浓度为 400 μg/mL的标准品溶液。精确吸取该标准溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL,于试管中稀释至0.5 mL,在55℃水浴中蒸干乙醇,加入0.5 mL蒸馏水,再加入26%香草醛乙醇溶液0.5 mL,于冰水浴中加入75%硫酸5 mL,摇匀,盖好瓶塞;于55℃水浴中加热25 min,取出摇匀,于冰水浴中冷却10 min,室温下放置20 min后,以试剂空白为参比,在584 nm处测定其吸光度。经回归分析,得到标准曲线的回归方程为 y=0.0013x+ 0.0003(R2=0.9936)。待测样品溶液吸光度的测定方法同上,平行双样,重复测定两次。计算公式为

(2)蛋白质保留率。依据GB/T 5009.5-2003,采用凯氏定氮法测定蛋白质含量,并计算蛋白质保留率:

(3)综合评分。综合考虑皂苷脱除率和蛋白质保留率对脱毒效果的影响后进行评价。计算公式为

1.3 数据处理

采用SPSS 18.0软件对试验数据进行方差分析和Duncan多重比较,显著性水平设为0.05。

2 结果与讨论

2.1 多棘海盘车脱毒单因素试验

分别进行柠檬酸浓度、脱毒温度、料液比和脱毒时间影响的单因素试验。为保证产品的品质达到食用要求并降低生产成本,利用柠檬酸对多棘海盘车进行脱毒时,需要合理控制柠檬酸浓度。

2.1.1 柠檬酸浓度对皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响 当脱毒温度为50℃、料液比为1∶6、脱毒时间为2 h时,溶液中不同柠檬酸浓度 (0~0.25 mol/L)对多棘海盘车皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响如图1所示。由图1可知,皂苷脱除率随柠檬酸浓度的增加而提高,当柠檬酸浓度由0增至0.25 mol/L时,皂苷脱除率由39.87%提高至71.24%,这是因为苷健具有缩醛结构,易被稀酸催化水解为苷元和糖,故酸性越高,皂苷的脱除率就越高,樊廷俊等[13]在用水抽提法提取多棘海盘车中的皂苷时也发现,皂苷在碱性条件下相对稳定,而在酸性条件下极易水解;当柠檬酸浓度由0升高至0.15 mol/L时,皂苷脱除率由39.87%升高至68.55%,提高比较明显,然而继续提高柠檬酸浓度,皂苷脱除率提高不显著 (P>0.05)。可见,将柠檬酸浓度控制在0.15 mol/L左右时,即可保证所得产品良好的脱毒效果。柠檬酸浓度对多棘海盘车蛋白质保留率亦有一定程度的影响,柠檬酸浓度愈大,蛋白质保留率愈低。这是由于当柠檬酸浓度由0增至0.05 mol/L时,溶液pH由8.03降低至2.30,当浓度继续增至0.25 mol/L时,pH值降低至1.86,而多数蛋白质在pH为4.0~10.0时比较稳定,超过此范围后蛋白质因离子基团产生强静电排斥作用而发生变性[14]。综上所述,皂苷脱除率与柠檬酸浓度呈正相关,而蛋白质保留率与柠檬酸浓度呈负相关。王长云等[7]在进行多棘海盘车脱毒试验时,建议粗总皂苷含量下降60%以上时即可认为脱毒符合使用安全要求。因此,本试验条件下,溶液中柠檬酸的最佳浓度范围为0.10~0.20 mol/L。

图1 柠檬酸浓度对多棘海盘车皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响
Fig.1 Effects of citric acid concentration on saponin desorption rate and protein retention rate

2.1.2 温度对皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响当柠檬酸浓度为0.10 mol/L、料液比为1∶6、脱毒时间为2 h时,不同处理温度 (30~80℃)对多棘海盘车皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响如图2所示。由图2可知:随着温度的升高,多棘海盘车皂苷脱除率呈递增趋势,当温度由30℃增至80℃时,皂苷脱除率由36.85%增至70.90%,即温度愈高,脱毒效果愈好,这是因为温度的提高减小了脱除液的黏度,扩散系数增加,从而加快了皂苷的溶解扩散速度,并且受热也容易造成皂苷分解[15];当温度为50℃时,多棘海盘车脱毒效果较优,皂苷脱除率为61.86%。温度对蛋白质保留率的影响亦比较明显,随着温度的提高,蛋白质保留率呈递减趋势,当温度由30℃增至80℃时,蛋白质保留率由97.25%降至80.66%,这是因为当蛋白质被逐渐加热并超过临界温度时,蛋白质将发生从天然状态至变性状态的剧烈转变,而大多数蛋白质在45~50℃时开始变性,并且在典型的变性范围内,当温度每提高10℃,变性反应速度约提高600倍[14]。综上所述,多棘海盘车皂苷脱除率与温度呈正相关,蛋白质保留率与温度呈负相关。因此,本试验条件下,多棘海盘车脱毒的最佳处理温度为50~70℃。

图2 处理温度对多棘海盘车皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响
Fig.2 Effects of tem perature on saponin desorption rate and protein retention rate

图3 料液比对多棘海盘车皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响
Fig.3 Effects of ratio of material to liquid on saponin desorp tion rate and protein retention rate

2.1.3 料液比对皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响 当柠檬酸浓度为0.10 mol/L、温度为50℃、脱毒时间为2 h时,不同料液比 (1∶2~1∶18)对脱毒多棘海盘车蛋白质保留率及皂苷脱除率的影响如图3所示。由图3可知,随着料液比的增大,多棘海盘车皂苷脱除率呈先上升后下降趋势,当料液比由1∶2提高至1∶10时,皂苷脱除率由31.36%迅速提高至64.18%,但当料液比继续提高至1∶18时,皂苷脱除率降低至47.04%。这是由于当料液比为1∶10时,皂苷扩散推动力较大,从而皂苷脱除率升高,这与李敏晶等[16]利用超声波提取法对海燕总皂苷进行提取试验时得出的结论一致。料液比对多棘海盘车蛋白质保留率的影响亦比较显著(P<0.05)。当料液比为1∶2时,其蛋白质保留率最高,为96.68%,当料液比增大至1∶18时,蛋白质保留率降至79.52%。这是因为较高的液固比可降低体系的黏度,从而使蛋白质溶解率提高[17]。综上所述,多棘海盘车皂苷脱除率随料液比的增大先升高而后降低,蛋白质保留率随料液比的增大而逐渐降低。但当料液比过高时,多棘海盘车皂苷脱除率和蛋白质保留率均较低,且大大增加了后处理的负担。因此,本试验条件下,最佳料液比为1∶10左右。

2.1.4 脱毒时间对皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响 当柠檬酸浓度为0.10 mol/L、温度为50℃、料液比为1∶6时,不同处理时间 (1~5 h)对脱毒多棘海盘车蛋白质保留率及皂苷脱除率的影响如图4所示。由图4可见,随着脱毒时间的延长,多棘海盘车皂苷脱除率逐渐提高,蛋白质保留率逐渐降低。当脱毒时间由1 h延长至2 h时,多棘海盘车皂苷脱除率的变化幅度达到最大,由49.28%提高至61.94%,提高了25.68%;而当脱毒时间延长至5 h时,与脱毒2 h比较,皂苷脱除率仅提高15.91%。这是因为在脱毒过程中,延长一定脱毒时间可使皂苷溶出含量随之增加,而继续延长时间会使细胞内大量不溶物及较多黏液质等混入脱毒液中,使溶液中杂质增多,黏度增大,从而增大了传质阻力,影响了皂苷的继续溶出[15]。随着脱毒时间的延长,多棘海盘车蛋白质保留率也随之降低。当脱毒时间由1 h延长至5 h时,蛋白质保留率由96.97%降低至72.08%;随着脱毒时间的继续延长,蛋白质保留率的降低幅度不断增大,当脱毒时间由3 h延长至4 h时,蛋白质保留率降低了9.23%;当脱毒时间由4 h延长至5 h时,蛋白质保留率降低了14.58%。综上所述,多棘海盘车皂苷脱除率随脱毒时间的延长而提高,蛋白质保留率随脱毒时间的延长而降低。因此,本试验条件下,最佳脱毒时间为2~4 h。

图4 脱毒时间对多棘海盘车皂苷脱除率及蛋白质保留率的影响
Fig.4 Effects of detoxification period on saponin desorption rate and protein retention rate

2.2 多棘海盘车脱毒工艺的正交试验

根据单因素试验结果,分别选取柠檬酸浓度、脱毒温度、料液比和脱毒时间4个因素,取值范围分别为0.10~0.20 mol/L、50~70℃、1∶8~1∶12 和2~4 h,以综合评分为目标值进行L9(34)正交试验,试验因素及水平如表1所示。试验结果和极差分析结果见表2,方差分析结果见表3。

表1 试验因素及水平
Tab.1 Factors and levels in the experiment

因素factor水平level A柠檬酸浓度/ (mol·L-1)concentration B C D脱毒温度/ ℃temperature料液比materiall/ liquid脱毒时间/ h time 1 0.10 50 1∶8 2 2 0.15 60 1∶10 3 3 0.20 70 1∶12 4

各个因素对综合评分的影响均极显著 (P<0.01)(表3)。极差分析结果表明,4个因素中脱毒温度 (B)对综合评分的影响最大,脱毒时间(D)对综合评分的影响也较大,料液比 (C)和柠檬酸浓度 (A)对综合评分的影响次之 (表2),影响综合评分的因素依次为B>D>C>A,得到最佳脱毒工艺条件组合为A1B1C1D2,即柠檬酸浓度为0.10 mol/L,脱毒温度为50℃,料液比为1∶8,脱毒时间为3 h。

表2 正交试验设计及试验结果
Tab.2 Design and results of the orthogonal test

试验号No. A B C D  综合评分comprehensive score 1.930 1.939 1.933 1.887 k2 1.898 1.877 1.907 1.933 k3 1.912 1.924 1.900 1.920 R 1 3 1 3 2 1.952 2 1 2 3 3 1.895 3 3 2 2 1 1.837 4 2 1 2 3 1.934 5 1 3 2 2 1.952 6 3 3 1 3 1.960 7 1 1 1 1 1.959 8 2 3 3 1 1.860 9 2 2 1 2 1.912 k1 0.032 0.062 0.033 0.046

2.3 验证试验

按优选的多棘海盘车脱毒工艺条件组合A1B1C1D2(柠檬酸浓度为0.10 mol/L,脱毒温度为50℃,料液比为1∶8,脱毒时间为3 h)进行3次重复试验,结果测得皂苷脱除率为70.96% (脱毒前皂苷含量为 0.068 7%,脱毒后皂苷含量为0.019 9%),蛋白质保留率为91.29% (脱毒前蛋白质含量为 30.35%,脱毒后蛋白质含量为27.71%),综合评分为1.982,高于表2中每一项试验结果,故A1B1C1D2为本试验条件下的最佳脱毒工艺条件组合。

表3 综合评分方差分析
Tab.3 Variance analysis of com prehensive score

注:F0.05(2,9)=4.26;**表示有极显著性差异 (P<0.01)
Note:F0.05(2,9)=4.26;**means very significant difference (P<0.01)

方差来源variance source显著性significant A 0.003 2 0.001 5.112平方和SS自由度df均差MS F值F value 0.002 9 0.000 ** B 0.012 2 0.006 20.924 ** C 0.003 2 0.002 5.911 ** D 0.006 2 0.003 10.460 **误差

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Optim ization of detoxification techniques of starfish Asterias amurensis by an orthogonal test

LISha,ZHANG Guo-chen,ZHANG Qian,LIXiu-chen,MU Chun-fa
(Research and Development Center of Fisheries Equipment and Engineering of Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Abstract:The optimum conditions of detoxification technology were investigated carried out in starfish Asterias amurensis by an orthogonal test.Single factor tests showed that saponin desorption rateswere improved and protein retention rateswere decreased under high citric acid concentration,high temperature and long detoxification period. Protein retention rates was reduced by increasing ratio ofmaterial to liquid,with the maximal saponin desorption rate at ratio ofmaterial to liquid ratio=1∶10.The detoxification conditions of starfish were optimized through the orthogonal testbased on single factor tests,and the significance order of the factors affecting the detoxification was expressed as detoxification period>temperature>ratio ofmaterial to liquid>citric acid concentration.The better detoxification wasobserved under conditions of citric acid concentration of 0.10 mol/L,temperature of 50℃,ratio ofmaterial to liquid=1∶8,and 3 h detoxification period,with saponin desorption rate of 70.96%,protein retention rate of91.29%and comprehensive score of1.982.

Key words:Asteriasamurensis;detoxification technique;citric acid;orthogonal test;saponin desorption rate;protein retention rate

中图分类号:TS254.4

文献标志码:A

DOI:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.014

文章编号:2095-1388(2016)02-0194-05

收稿日期:2015-06-26

基金项目:辽宁省科学技术计划项目 (2015103021);辽宁省教育厅科学技术研究项目 (042214106)

作者简介:李莎 (1991—),女,硕士研究生。E-mail:634894053@qq.com

通信作者:张国琛 (1965—),男,博士,教授。E-mail:zhangguochen@dlou.edu.cn