表1 玛丽鱼二倍体染色体的计数结果
Tab.1 Chromosom e counts in the d ip loidy sailfin molly Poecilia latipinna
染色体数目chromosome number分裂相数目number ofmetaphase占百分比/％ percentage 43 1 1 44 4 4 45 5 5 46 82 82 47 6 6 48 2 2总计total 100 100
摘要：为获得玛丽鱼Poecilia latipinna细胞遗传学数据，以玛丽鱼的鳃丝和鳍条为试验材料，采用秋水仙素浸泡、低渗处理和热滴片法制备染色体标本，分析其染色体的核型和银染 （Ag-NORs）。结果表明：玛丽鱼具有23对染色体，核型2n=46t，NF=46；Ag-NORs出现在t2和t9的染色体末端，其数目具有多态性，未发现性染色体。本研究结果可为研究玛丽鱼的遗传方式提供基础资料。
关键词：玛丽鱼；染色体核型；银染
玛丽鱼 Poecilia latipinna隶属于脊索动物门Chordata、硬骨鱼纲 Osteichthyes、鳉形目 Cyprinodontiformes、花鳉科Cyprinodontidae、花鳉属Poecilia，是一种具有较高经济价值的观赏鱼，原产于北美洲佛罗里达半岛、墨西哥湾和美国北卡罗来纳州大西洋沿海一带，后引进到亚洲，并有多种人工改良品种。玛丽鱼体色多样，有白玛丽、黑玛丽、黄玛丽和杂交后的多色玛丽。雄鱼背鳍竖直，像一张帆，用来引诱雌鱼，其臀鳍已变成棒状结构，用来与雌鱼完成体内受精。玛丽鱼是一种卵胎生鱼，受精与胚胎发育在体内进行，且胚胎发育所需的营养成分主要来自卵本身的养分。玛丽鱼在淡水和半咸水环境中均可栖息生存，耐污能力强，在低溶氧环境中亦可存活，以藻类及其他有机物为食物来源［1］。
目前，国内外对花鳉科其他鱼类的研究较为深入，如剑尾鱼属Xiphophorus的剑尾鱼Xiphophorus helleri和月光鱼Xiphophorusmaculatus。对玛丽鱼的研究主要集中在生理［2］、雄性体长与形态发育［3］、生态［1］、动物行为［4］和分子系统发育［5］等方面，而对其核型组成、Ag-NORs方面的研究尚未见报道。本研究中，对玛丽鱼染色体核型和带型进行了分析，旨在探究玛丽鱼遗传物质的特点，为深入研究其遗传方式提供基础资料。
1.1 材料
试验用玛丽鱼取自北京市观赏鱼市场，将试验鱼带回实验室后养殖于水族箱中，养殖水温为26℃。选取45日龄左右、体长为1～2 cm的幼鱼10尾，剪取鳃丝和鳍条，制备染色体标本；选取3～4月龄的玛丽鱼10尾，只用其鳃丝部分，制备染色体标本。
1.2 方法
1.2.1 染色体标本的制备 参照Haaf等［6］和周丽青等［7］的方法并稍作改进。室温下，将玛丽鱼放入0.01％秋水仙素溶液中6 h，剪取鳃丝和鳍条，在25℃下置于10 mL 0.037 5 mol/L KCl溶液中分别低渗约30、50 min。
将低渗后的鳃丝放入甲醇与冰醋酸 （体积比为9∶1）的固定液中浸泡8 min，再放入纯冰乙酸中浸泡处理1～2 min；用卡诺氏固定液固定2次（每次均为50 min），之后放入冰箱 （4℃）中固定。取蒸馏水和冰乙酸，并按体积比1∶1混合，将固定过的鳃丝放入其中，轻轻摇动，1 min后取出鳃丝，所得液体用于滴片。
将低渗后的鳍条用卡诺氏液固定3次，每次30 min，之后放在冰箱（4℃）中过夜，次日用50％的冰醋酸液处理10min，再用移液枪反复吹打，然后静置，使杂质沉降，吸取上层液体用于滴片。
用加湿器稍微加湿空气 （空气湿度50％），室温下采用热滴片方法，将细胞悬液滴到控温电热板（50～60℃）的干净玻片上，5 min后吸除玻片上残留的液体。
用磷酸盐缓冲液 （pH 7.2）将吉姆萨原液按9∶1的比例稀释成工作液 （现用现配）。取干燥后的染色体标本片染色20 min后取出，用蒸馏水冲洗以去除染液，干燥后即可用于观察分析。
1.2.2 核型分析 使用Olympus BX63型显微镜观察处理后，对染色体标本片进行染色体计数，并选择10个优良分裂相在油镜下摄影。使用 ImageJ 1.48软件对染色体进行测量，并按其特点用VideoTesT-Karyo 3.1染色体核型分析软件进行同源染色体配对，按照Levan等［8］的划分标准进行分类。
1.2.3 银染 参照Howell等［9］的方法略作修改。将制备好的染色体标本片放于洁净培养皿中，并置于60～70℃水浴中，在标本上滴加50％硝酸银与2％明胶 （内含1％甲酸）以2∶1比例混合的混合液，覆盖玻片。2～4min后取出玻片，用预热蒸馏水冲洗，并于干燥后镜检和拍照。
2.1 玛丽鱼鳃丝细胞染色体数目的确定
选取玛丽鱼鳃丝细胞100个中期分裂相染色体，计数确定其染色体数目。结果显示，玛丽鱼染色体的数目在100个中期分裂相中，出现最多的是46，占细胞总数的82％ （表1）。因此，可以确定玛丽鱼的染色体数目为2n=46。
表1 玛丽鱼二倍体染色体的计数结果
Tab.1 Chromosom e counts in the d ip loidy sailfin molly Poecilia latipinna
染色体数目chromosome number分裂相数目number ofmetaphase占百分比/％ percentage 43 1 1 44 4 4 45 5 5 46 82 82 47 6 6 48 2 2总计total 100 100
2.2 玛丽鱼染色体核型分析
选取染色体分散好且数目完整的中期分裂相10个，测量染色体臂长度，计算其相对长度，得出玛丽鱼染色体形态参数。从表2可知，玛丽鱼染色体二倍体体细胞的46条染色体可配对成23对同源染色体，按Leven等［8］的划分标准，23对染色均为端部着丝粒染色体 （t）。
表2 玛丽鱼染色体对的相对长度、臂比及其分类类型（平均值±标准差）
Tab.2 Relative length，arm ratio and classified types of chrom osome in sailfin molly Poecilia latipinna （mean±S.D.）
染色体序号chromosome pair No.类型type 1 6.62±0.43 ∞相对长度/％ relative length臂比arm ratio t 5.57±0.13 ∞ t 3 5.42±0.08 ∞ t 4 5.26±0.11 ∞ t 5 5.16±0.12 ∞ t 6 4.96±0.09 ∞ t 7 4.74±0.04 ∞ t 8 4.66±0.05 ∞ t 9 4.57±0.04 ∞ t 10 4.43±0.04 ∞ t 11 4.39±0.05 ∞ t 12 4.30±0.03 ∞ t 13 4.20±0.05 ∞ t 14 4.13±0.03 ∞ t 15 4.03±0.06 ∞ t 16 3.91±0.09 ∞ t 17 3.82±0.08 ∞ t 18 3.77±0.07 ∞ t 19 3.69±0.05 ∞ t 20 3.66±0.05 ∞ t 21 3.55±0.05 ∞ t 22 2.80±0.50 ∞ t 23 2.37±0.51 ∞2 t
在试验结果中，未发现异型性染色体、次缢痕和随体结构的存在，因此，玛丽鱼的核型公式可表示为2n=46t，且NF=46。根据测量结果，配对玛丽鱼各对同源染色体，即可得玛丽鱼染色体核型图（图1）。试验过程中发现，用同一条鱼细胞制作的染色体标本中，鳃丝比鳍条所呈现的染色体中期分裂相较多。同样是使用鳃丝，幼鱼比成鱼的鳃丝更易获得较多染色体中期分裂相。
图1 玛丽鱼染色体中期分裂相和染色体核型
Fig.1 M etaphase chromosom es and karyotype of sailfin m olly Poecilia latipinna
2.3 鳃丝细胞银染核型
在玛丽鱼鳃丝细胞的中期分裂相中，Ag-NORs的数量有两种情况 （图2），细胞中有2个Ag-NORs和1个Ag-NORs出现的中期分裂相频率分别为78.8％与21.2％，分别位于t2和t9中的一条染色体上，且银染点出现在染色体靠近着丝粒的末端。
注：A为细胞中具1个Ag-NORs的中期分裂相；B、C分别为细胞中具有2个Ag-NORs的中期分裂相及其核型图 （箭头指银染位点）
Note：A，themetaphase with one Ag-NORs in cells；B，C，themetaphase with two Ag-NORs in cells and its karyotype（arrow showing silver dying sites）
图2 玛丽鱼的Ag-NORs数目
Fig.2 Number of Ag-NORs in sailfin molly Poecilia latipinna
玛丽鱼染色体的Ag-NORs在玛丽鱼间期鳃丝细胞中细胞中数量也存在差异 （图3），数目为1个或2个。细胞中有2个Ag-NORs和1个Ag-NORs出现的频率分别为72.8％与27.2％，含有2 个Ag-NORs的细胞数量明显多于含有1个Ag-NORs的细胞。
图3 玛丽鱼染色体Ag-NORs之间的相对大小
Fig.3 Dimension of Ag-NORs in sailfin molly Poecilia latipinna
对试验获得的间期核观察可知，玛丽鱼间期核中的NORs呈现大小不一的现象，小的为圆点状，大的类似圆盘状 （图3），但这种差异不大。
本试验中，采用秋水仙素直接浸泡鱼体和热滴片的方法制备染色体标本片，试验准备阶段需将载玻片反复清洗备用。低渗处理时间会影响细胞染色体分裂相，不同鱼类低渗时间差别不大［10］。在滴片过程中，环境温度和湿度对中期分裂相的分散程度影响很大。
3.1 玛丽鱼的核型分析
关于玛丽鱼的核型研究国内外未见报道，国外对花鳉科鱼类核型的研究较多。Nanda等［11］在研究花鳉科鱼类的性染色体过程中，对帆鳍玛丽Poecilia velifera、孔雀鱼 Poecilia reticulata、Poeciliasphenops、剑尾鱼和月光鱼进行了C带显带试验和合成探针的DNA杂交试验。结果表明：帆鳍玛丽具有23对染色体，通过探针杂交试验表明，雌性可能存在W染色体；孔雀鱼含有雄性异性性染色体，共有23对染色体；Poecilia sphenops则是ZZ/ ZW性别决定系统，具有23对染色体；剑尾鱼和月光鱼都是24对染色体且未发现性染色体。本试验中，玛丽鱼的染色体数目为2n=46，其染色体数目与花鳉科的其他鱼类比较接近。在鱼类系统进化上，根据学者对于鱼类演化类群的划分［12-13］，玛丽鱼属于高位类鱼类。
3.2 玛丽鱼染色体Ag-NORs
核仁组织者 （NORs）存在于染色体上的次溢痕部位，与物种间亲缘关系联系密切［14］。1977年，Kligerman等［15］最早将Ag-NORs方法用来研究鱼类染色体，之后对鱼类NORs的研究不断深入，国内学者也对多种鲤科鱼类进行了Ag-NORs的研究［16-17］。NORs的数目一般是比较固定的，同一科属中的不同种都可能是一致的。在剑尾鱼的银染试验中发现，其Ag-NORs数量为1～2个，但绝大多数为2个［18］。在很多鱼类中发现，NORs具有多态性，不仅数目具有多态性，而且NORs的位置结构也有不同类型。玛丽鱼和剑尾鱼Ag-NOR的数量很相似，本研究中发现，玛丽鱼NORs显示的数目为1～2个，且2种数目的NORs出现的频率也不相同。
玛丽鱼Ag-NORs的大小也有不同，有点状和圆盘状两种，这也反映出Ag-NORs的结构多态性。银染的面积大小和银染的强弱是由NORs的转录活性决定的，根据染色体上NORs与rDNA之间的对应关系可知，NORs的银染与否以及NORs银染强度均与rDNA的转录活性息息相关，Ag-NORs表现出的多态性在一定程度上反映了rDNA的转录活性［19］。大多数鱼类只含有一对存在Ag-NORs的染色体［20］，例如蓝曼龙 Trichogaster trichopterus［21］、布氏石斑鱼Epinephelus bleekeri［22］、麦穗鱼Pseudorasbora parva［19］和六带石斑鱼Epinephelus sexfasciatus［23］等，而且Ag-NORs都是位于一对同源染色体上。玛丽鱼Ag-NORs并非在一对同源染色体上，且t2与t9上的Ag-NORs大小不同，这说明玛丽鱼细胞中这两个NORs转录活性不同。类似的情况也出现在准噶尔雅罗鱼Leuciscusmerzbacheri中，2个Ag-NORs不在一对同源染色体上［24］。由于NORs一般位于次缢痕区域，玛丽鱼染色体中很有可能存在次缢痕，但此结构在玛丽鱼中并未发展到能够分辨的程度。
本试验中并未发现玛丽鱼的性染色体，未来需要通过其他分子生物学手段，进一步探究玛丽鱼是否存在性染色体以及性别决定机制。目前世界各国实验室的模式生物试验用鱼种类包括：斑马鱼、剑尾鱼、青鳉、河鲀等［25］，玛丽鱼具有同这些模式生物试验用鱼相似的生物学特性，是潜在的又一模式生物，未来对其基因组的深入研究，将会对动物遗传以及动物进化的研究起到很大帮助。
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Karyotype and Ag-NORs of sailfin molly Poecilia latipinna
Abstract：Themetaphase chromosome spreadingwas conducted in gills and fins cells of sailfinmolly Poecilia latipinna by colchicine-low concentration-hot film drops，and Ag-NORs were analyzed to obtain cytogenetic data of sailfin molly.The results showed that the karyotype of sailfin molly composed of 2n=46t，NF=46.Ag-NORswere found on the end of chromosome No.2 and chromosome No.9，and the Ag-NORs polymorphismswere individually specific，while no sex chromosome was observed in this fish.The findingswill provide reference to genetic pattern of sailfinmolly.
Key words：Poecilia latipinna；karyotype；Ag-NORs
中图分类号：S917.4
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.006
文章编号：2095-1388（2016）02-0151-05
收稿日期：2015-06-23
基金项目：中国农业大学科技基金资助项目 （88057007）