图1 反应温度对酶催化降解海水中柴油污染的影响
Fig.1 Effect of reaction temperature on enzymatic oxidation of marine diesel pollution
摘要：为深入探索酶催化技术在海洋石油污染处理中的应用，以游离辣根过氧化物酶 （HRP）催化降解海水中柴油污染，研究了酶用量、溶液pH值、柴油初始浓度和催化反应时间等因素对酶催化降解海水中柴油污染的影响，确定了HRP催化降解海水中柴油污染的优化工艺条件，同时考察了反应助剂对海水中柴油污染去除率的影响。结果表明：HRP能有效催化降解海水的柴油污染，当海水中柴油的质量浓度为1.2 g/L时，在温度为25℃、HRP加入量为1.6 U/mL、H2O2为250 mg/L、溶液pH为5的条件下，催化降解3 h，柴油去除率可达90.77%；聚乙二醇 （PEG）对HRP催化降解海水中的柴油污染有较显著的影响。
关键词：游离辣根过氧化物酶；海洋油污染；聚乙二醇；酶催化氧化
近年来，海洋溢油事故的频繁发生以及近海工业、运输业的发展，导致大量含油污水流入海洋，石油类化合物已成为海洋污染主要的污染物之一［1］。在处理海洋石油污染特别是海洋溢油事故时，采用物理方法收集溢油后，海水中残留的石油足以破坏生态环境，而采用化学方法处理常会导致二次污染［2］，因此，寻求高效、快速修复海洋石油污染显得更加迫切。用酶处理石油污染具有高效、快速等优点［3］。自20世纪80年代初起，有学者研究发现，酚氧化酶和木质素分解酶，如辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶、酪氨酸酶和漆酶，是一类特异性比较低的酶，它能同时进行催化氧化反应和化学聚合，克服了酶的单一性，为酶催化技术在海洋石油污染处理中的应用开辟了一条新途径［4-6］。本研究中，以游离辣根过氧化物酶催化降解模拟柴油污染海水，研究了酶催化降解柴油污染中的酶用量、pH值、柴油浓度和催化反应时间等因素对催化降解柴油的影响，旨在寻求一种高效、经济、清洁的海洋柴油污染处理方法。
1.1 材料
试验试剂主要有游离辣根过氧化物酶 （HRP）（活力250 U/mg以上）、聚乙二醇 （PEG）、4-氨基安替比林、30%过氧化氢。试验仪器主要有低速离心机、pH计、752紫外可见分光光度计。
1.2 方法
取100 mL模拟油污染海水置于250 mL锥形瓶中，用磷酸盐缓冲液预先调节含油水样的pH至一定值，加入试验量的HRP溶液和H2O2溶液，塞住瓶口，置于可调温的摇床中进行恒温反应。从H2O2加入开始计时，反应完毕后分别加入160 mg/L的Al2（SO4）3，以3000 r/min离心15 min，用分光光度法测定上清液中残存柴油的含量。测定反应助剂影响时在加入H2O2前先加入PEG。
2.1 温度对酶催化降解海水中柴油污染的影响
在海水的油污染浓度为1.2 g/L、HRP为1.6 U/mL、H2O2为350 mg/L、pH为7.5条件下，改变反应温度 （15～30℃），考察其对酶催化降解海水中柴油污染的影响，结果如图1所示。由图1可知，随着反应温度的升高，去除率逐渐增大，当温度为25℃时效果最好，继续升高温度，去除率下降。原因可能是生物酶在一定温度下保持了较高的活性，并且不同的酶有不同的温度界限，当温度超过酶的温度界限后，酶催化反应速率就会明显降低。试验结果表明，HRP在15～25℃范围内有较好的催化氧化活性，30℃是达到催化氧化的温度界限，温度再升高，HRP对柴油的去除率明显下降。因此，本试验条件下最佳反应温度为25℃。
图1 反应温度对酶催化降解海水中柴油污染的影响
Fig.1 Effect of reaction temperature on enzymatic oxidation of marine diesel pollution
2.2 反应时间对酶催化降解海水柴油污染的影响
在海水的油污染浓度为1.2 g/L、HRP为1.6 U/mL、H2O2为350 mg/L、pH为7.5、反应温度为25℃条件下，改变反应时间 （0.5～5.0 h），考察其对酶催化降解海水中柴油污染的影响，结果见图2。由图2可知，反应进行的前3 h，柴油去除率随反应时间的延长逐渐增大，3 h后去除率仅略微增大。这可能是因为反应一定时间后，由于反应体系中底物 （油、过氧化氢）的减少，反应逐渐趋于平缓，继续延长时间，反应速率增长就很慢。因此，本试验条件下反应时间控制在3 h较合适。
图2 反应时间对酶催化降解海水中柴油污染的影响
Fig.2 Effect of reaction time on enzymatic oxidation of marine diesel pollution
2.3 HRP浓度对酶催化降解海水柴油污染的影响
在海水的油污染浓度为1.2 g/L、H2O2为350 mg/mL、pH为 7.5、温度为25℃条件下，改变HRP浓度 （0.4～2.4 U/mL），在恒温水浴锅内震荡3 h，用分光光度法测定反应后柴油的去除率，结果如图3所示。由图3可知，随着HRP浓度的增加，柴油去除率逐渐增大，当酶浓度为 1.6 U/mL时，柴油去除率达到最大值，此后，随着HRP浓度的增加，柴油去除率反而降低，说明过量的HRP不利于柴油的去除。原因可能是在最佳HRP用量的条件下，HRP与水样中的有机物反应最为充分，两者之间达到了最佳反应平衡，但随着HRP浓度的增加，可能将酶包覆在所形成的聚合物中，影响了HRP活性的发挥，使酶的催化氧化反应效率降低，从而影响了柴油去除率。乔彤森等［7］也有相似的试验结果。因此，本试验条件下最佳HRP浓度范围为1.2～2.0 U/mL。
图3 酶浓度对催化降解海水中柴油污染的影响
Fig.3 Effect of horseradish peroxidase（HRP）concentration on enzymatic oxidation of marine diesel pollution
2.4 pH对酶催化降解海水中柴油污染的影响
在海水的油污染浓度为1.2 g/L、HRP为1.6 U/mL、H2O2为350 mg/L、温度为25℃条件下，改变溶液的pH值 （5.0～9.0），考察pH对酶催化降解海水中柴油污染的影响，结果如图4所示。由图4可知，pH从5.0增至7.5时，随着pH的增大，柴油去除率逐渐增大，当pH为7.5时，柴油去除率达到最大值，为73.23%，此后随着pH的增大，柴油去除率逐渐降低。产生这种现象的原因可能是：①由蛋白质组成的酶对pH的变化非常敏感；②过酸或过碱的催化环境使酶的空间结构遭到破坏，造成酶活性丧失；③过酸或过碱的反应条件可能使底物不能完全分解成产物或影响了底物的解离。图4也与多数情况下，酶催化反应速度随pH的变化呈左右对称的 “钟罩”型图相符合［8］。本试验中还发现，当pH为6.0～8.0时，HRP催化反应都有较大的酶催化降解率。因此，本试验条件下最佳pH为7.5。
2.5 H2O2浓度对酶催化降解柴油污染的影响
在海水的油污染浓度为1.2 g/L、HRP为1.6 U/mL、温度为25℃、pH为 7.5条件下，改变H2O2的浓度 （50～750 mg/L），考察其对酶催化降解海水中柴油去除率的影响，结果如图5所示。由图5可知，随着H2O2浓度的增加，柴油去除率逐渐增大，当H2O2浓度为350 mg/L时，去除率达最大值，继续增大H2O2浓度，柴油去除率逐渐减小。原因可能是高浓度H2O2溶液变成酶催化反应的抑制剂，使酶内部肽链断裂，破坏酶的空间构象，使其失去催化功能；而H2O2的量不足，则不能达到最佳降解效果［9］。
图4 pH对酶催化降解海水中柴油污染的影响
Fig.4 Effect of pH value on enzymatic oxidation of marine diesel pollution
图5 H2O2浓度对酶催化降解海水中柴油污染的影响
Fig.5 Effect of H2O2concentration on enzymatic oxidation of marine diesel pollution
2.6 PEG对HRP催化氧化反应的影响
近来一些研究表明，壳聚糖、PEG等大分子可用来修饰酶表面的氨基酸［10］。本试验中选取PEG（酶活力为500～20 000 U）这种既溶于水又溶于大多数有机溶剂的两性分子，PEG的修饰可以保护稳定酶分子构向的次级链，从而使酶具有抵抗热、酸、碱对其破坏的能力。本试验中，在海水的油污染浓度为1.2 g/L、HRP为1.6 U/mL、pH 为7.5、H2O2浓度为350 mg/L、温度为25℃条件下，在反应体系中添加不同浓度的PEG（0～160 mg/L）作为反应助剂，考察其对酶催化降解海水中柴油污染的影响，结果如图6所示。由图6可知，反应体系中加入PEG后，随着其浓度的增加，柴油去除率逐渐增大，当PEG浓度为160 mg/L时，去除率最大，可见，PEG在酶催化降解柴油污染反应中有一定的促进作用，影响效果较明显。
图6 反应助剂对酶催化降解海水中柴油污染的影响
Fig.6 Effeet of reaction additive concentration on enzymatic oxidation of marine diesel pollution
2.7 酶催化降解海水中柴油污染的优化试验条件
选择HRP浓度、pH、酶催化反应时间、酶催化反应温度、双氧水浓度5个因素进行L16（45）正交试验，结果如表1所示。极差分析结果表明，影响酶催化降解海水中柴油污染的各因素的主次关系依次为：温度＞反应时间＞HRP浓度＞溶液pH＞H2O2浓度，理论最优组合为 A1B3C3D4E2，即 pH 为5、反应时间为3 h、温度为25℃、HRP浓度为2.0 U/mL、H2O2浓度为150 mg/L条件下，柴油去除效率最好。但从表1可见，正交试验的第3号试验组合 （A1B3C3D3E3）的柴油去除率最高，达到90.77%，该组合为试验中效果最好的组合。考虑到实际操作中的成本问题、单因素试验结果和正交试验结果，结合HRP浓度在最佳浓度1.6 U/mL 和H2O2在最佳浓度350 mg/L左右时对催化反应的影响均较显著，以及正交试验中第3号试验组合的高去除率，因此，本试验中确定正交试验中的第3号试验组合为最优试验组合，即酶催化降解海水中柴油污染的优化试验条件为：pH为5，HRP浓度为1.6 U/mL，反应温度为25℃，反应时间3 h，H2O2浓度为250 mg/L。
（1）游离辣根过氧化物酶能有效催化降解海水中的柴油污染，其中酶用量、溶液pH、温度和催化反应时间等因素对酶催化降解海水中柴油污染有较显著影响，影响酶催化降解海水中柴油污染的各因素的主次关系依次为反应温度＞反应时间＞催化剂HRP浓度＞溶液pH＞H2O2浓度。
（2）酶催化降解海水的柴油污染的优化试验条件：海水的油污染浓度为1.2 g/L、HRP酶浓度为1.6 U/mL、H2O2浓度为250 mg/L、pH为5、催化反应温度为25℃、反应时间为3 h。在此条件下，柴油去除率可达90.77%。
（3）PEG在酶催化氧化柴油的反应中有一定的促进作用，添加PEG能有效提高游离辣根过氧化物酶HRP催化降解海水中柴油污染的去除率，且随PEG浓度的增加，去除率不断升高。
表1 正交试验设计及试验结果
Tab.1 Designed matrix and results for orthogonal experiment
试验号No. A pH B时间/h reaction time C温度/ ℃temperature D HRP/ （U·mL-1）HRP concentration E双氧水/ （mg·L-1）H2O2 concentration柴油去除率/% diesel removal rate 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 k 1 k2 k3 k4 R 5 5 5 5 6 6 6 6 7.5 7.5 7.5 7.5 8 8 8 8 55.06 54.21 46.13 41.41 54.59 1 2 3 4 4 3 2 1 2 1 4 3 3 4 1 2 57.29 35.78 58.23 45.50 89.8 15 20 25 30 25 30 15 20 30 25 20 15 20 15 30 25 49.04 39.70 72.94 35.13 151.25 0.8 1.2 1.6 2.0 1.2 0.8 2.0 1.6 1.6 2.0 0.8 1.2 2.0 1.6 1.2 0.8 41.12 49.46 50.89 55.33 56.85 50 150 250 350 50 150 250 350 50 150 250 350 50 150 250 350 50.31 52.37 50.46 43.66 34.85 56.02 35.57 90.77 37.88 75.62 44.26 48.02 48.95 21.43 87.27 26.11 49.72 48.18 42.41 36.95 38.11
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Catalytic oxidation degradation of marine diesel pollution by horseradish peroxidase
Abstract：The influence of dosage，solution pH value，diesel initial concentration and catalytic period on free horseradish peroxidase（HRP）degradation of marine diesel pollution were studied and optimized for the process conditions by orthogonal experiment to exploite utilization of horseradish peroxidase in the catalytic oxidation degradation of marine diesel pollution.The removal of marine diesel pollution by a reaction promoter was observed.The results showed that free horseradish peroxidase was shown to degradate the diesel pollution in the seawater effectively under the optimum conditions of diesel initial concentration of 1.2 g/L，temperature of 25℃，HRP activity concentration of 1.6 U/mL，H2O2mass concentration of 250 mg/L，pH 7.5 and reaction time of 3 h，with the diesel removal rate of 90.77%.It was found that polyethylene glycol（PEG）improved the efficiency for HRP catalytic oxidation in seawater diesel pollution.
Key words：horseradish peroxidase（HRP）；marine oil pollution；polyethylene glycol（PEG）；enzymatic oxidation
中图分类号：X703.1
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.019
文章编号：2095-1388（2016）01-0113-04
收稿日期：2015-04-26
基金项目：国家海洋公益性行业科研专项 （201305002）；辽宁省海洋渔业厅科研项目 （2011024）；国家海洋局海洋溢油鉴别与损害评估技术重点实验室开放课题 （201205）