池塘养殖锦鲤体表溃疡病的组织病理学观察
曲明志，潘连德
（上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海201306）
摘要：为临床诊断和防治锦鲤Cyprinus carpio koi皮肤溃疡病，采用病理解剖方法对患病锦鲤进行临床观察和组织病理学分析，试验用患病锦鲤取自上海市朝阳锦鲤养殖场发病池塘，确定病鱼10尾 （编号1～10），取每条病鱼的组织进行病理解剖、石蜡切片、H-E染色。结果表明：患病锦鲤体表溃疡病处的病灶组织出现严重淤血、炎性细胞浸润并聚集、肌束溶解和坏死等典型病理表现；体表溃疡病是由致病菌局部感染所致，并未全身性感染，10尾病料的脾组织均表现出血管扩张、管壁增厚、血管周围的实质组织凝固变性，伴有红细胞坏死和凝固变性区域内部分组织坏死等较为一致的病理特征，可以诊断为血液中有毒物质引起的脾组织病变，导致脾功能低下；肝胰组织和肾组织较脾组织病变相对较轻；肠、心、鳃、头肾组织等基本正常。研究表明，本病例全部样品均有不同程度的脾凝固变性、肝组织淤血、肾组织间质充血及其组织中血管扩张、管壁增厚的病理变化，这与体表溃疡病变无直接关联。
关键词：锦鲤；皮肤溃疡病；脾凝固变性；组织病理
随着池塘养殖锦鲤 Cyprinus carpio koi产业的发展，中国境内的锦鲤养殖规模在不断扩大。锦鲤体表溃疡病已成为大面积池塘养殖的常见病，该病病程较长，可导致锦鲤持续死亡，并可降低其观赏价值［1-2］。引起锦鲤溃疡病的病原主要有嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila［1，3］、维氏气单胞菌Aeromonas veronii［4-5］、温和气单胞菌 Aeromonas sobria［6］、摩氏摩根氏菌 Morganella morganii［2，7］、杀鲑气单胞菌 Aeromonas salmonicida［8-9］、柱状黄杆菌Flavobacterium columnare［10］和滑行细菌 Gliding bacteria［11］等。此外，还有从患有溃疡症状锦鲤体内分离出病毒［12-13］及寄生虫［14］的报道，可见锦鲤溃疡病的病原十分复杂。患该病的锦鲤以鳞片脱落、肌肉充血、体表不同程度的溃疡为主要病变特征［7］，部分肠道鼓气、发炎［2，5］，肝胰脏呈褐色、肿大或淤血并伴有血样腹水［4，15-16］，可见锦鲤溃疡病的病症较为复杂多样，甚至锦鲤许多疾病常表现有溃疡症状［17］。目前，仅见对滑行细菌引发的锦鲤溃疡病的组织病理学研究，但没有病灶组织病理结果，并推断为菌血症或败血症致死［11］。因此，锦鲤溃疡病的病原、病理等涉及临床诊断的关键问题还有待进一步研究。本研究中，对上海市朝阳锦鲤养殖场2015年暴发的溃疡病病例进行详细地临床解剖和组织病理学观察，以期为该病的诊断及防治研究提供相应依据，也为锦鲤危重疾病的临床病理诊断和病因分析提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用患病锦鲤取自上海市朝阳锦鲤养殖场发病池塘 （1号、2号）。按照锦鲤患病临床症状进行采样，每份样品均为患病活体，无濒死个体。患病锦鲤体长为21.5～25.5 cm，体质量为213～315 g。将数十尾样品运回至上海海洋大学水族宠物医学实验室进行临床检验和病理解剖，初步诊断并排除其他病例后，确定病鱼10尾 （编号1～10），进一步进行病理观察和诊断。同步无菌操作采集相关组织进行病原菌分离鉴定，结果另文发表。
1.2 方法
1.2.1 病鱼的临床症状与病理解剖观察 对编号
为1～10号的病鱼分别记录临床症状并进行病理解剖观察，主要观察各组织器官的病变情况、轻重程度，拍照，进行初步临床症状诊断，并确定各个样本的典型病变部位。
1.2.2 组织病理学切片的制备与观察 参考“1.2.1”节的结果，取每个病例的肝胰脏、脾脏、头肾、中肾、心脏、肠道、病灶和鳃组织，并切成0.5 cm3小块，用体积分数为10%的中性福尔马林固定24 h后，经流水冲洗组织块数小时，用体积分数为50%～100%的乙醇溶液逐级脱水，用二甲苯将其透明、石蜡包埋、切片 （厚度5 μm）、烤片，用苏木素-伊红（H-E）染色、中性树胶封片，自然风干后在LeicaDM3000显微镜下观察并拍照。
2 结果与分析
2.1 患病锦鲤临床症状和病理解剖特征
患病锦鲤在池塘中聚成小群或独游，行动迟缓，反应迟钝，受外界刺激趋避能力差，严重者甚至死亡。另外，患病个体病程较长，每日死亡几尾到数十尾不等，持续数月，死亡率达20%。2、4、5号典型患病个体，体表出现红色或灰白色等不同程度、不同部位、不同大小的溃疡灶 （图1-A）；3、8、9和10号病症较轻个体，体表出现不同大小红斑、鳞囊出血或部分鳞片溃疡形成缺刻，缺刻周缘有少量血液，有的个体各鳍条充血尤以尾鳍更加明显，肛门红肿 （图1-B）；随着病情的发展，1、7号中度患病个体，体表多处出现点状溃疡，溃疡部位皮肤隆起、鳞片脱落，病灶周围皮肤及肌肉组织发炎、充血或出血，且多集中在病鱼腹部，有的患病个体眼球突出，病灶周围呈现局部竖鳞症状 （图1-C）；随着病鱼溃疡灶逐渐扩大、加深，鱼体会形成明显凹陷，患病末期，重度患病个体溃疡灶遍布全身，溃疡处肌肉溶解、坏死、化脓呈灰白色，6号病鱼甚至体表穿孔、露出骨骼和内脏，最终死亡 （图1-D）。
图1 患病锦鲤临床症状和病理解剖
Fig.1 Clinical symptoms and pathological anatomy of sick koi carp
注：A为5号病鱼体表大面积溃疡，露出红色肌肉组织 （↑）；B为3号病鱼鳞囊出血形成缺刻，尾鳍周缘充血；C为1号病鱼眼球突出伴有局部竖鳞症状 （↑）；D为6号病鱼肛门严重溃疡并与内脏通透 （↑）；E为10号病鱼鳃组织淤血；F为9号病鱼头肾、中肾略肿大淤血，肝胰脏淤血；G为1号病鱼肝胰脏点状淤血 （↑），腹腔内含大量带血腹水；H为7号病鱼中肾略肿大、淤血 （↑）；I为9号病鱼肠道充血；J～L为正常对照组锦鲤及解其剖图
Note：A，a large area of the ulcer surface in sample No.5，revealing a red muscle tissue（↑）；B，scale follicle in is bleeding in sample No.3 with the formation of defect；C，exophthalmic symptoms associated with local vertical scale（↑）in sample No.1；D，severe anal ulcer and exposed viscera（↑）in sample No.6；E，gills containing extravasated blood in sample No.10；F，head kidney，mesonephron and hepatopancreas are slightly swollen and contain extravasated blood in sample No.9；G，hepatopancreas shows punctate extravasated blood（↑）in sample No.1，there are plenty of ascites in the abdominal cavity；H，mesonephron is slightly swollen and contains extravasated blood（↑）in sample No.7；I，a bit of blooding congestion is in the intestine in sample No.9；J-L，normal control
临床解剖观察，除3、5号病鱼鳃丝末端溃烂、缺损呈淡黄色外，其他病鱼鳃组织均有不同程度的淤血 （图1-E）；全部样本 （1～10号）肝胰腺均略肿大、不同程度的淤血并呈暗红色或红褐色（图1-F、G）；胆囊胆汁充盈；脾脏、头肾、中肾基本正常或略有肿大 （图1-F、H）；部分围心腔含有大量血液，心脏呈暗红色；大部分为空肠，肠道充血 （图1-I）；1、3、5号患病个体出现不同程度的腹水。
2.2 患病锦鲤组织病理观察
肝胰组织：除1号患病个体外，其他病料（2～9号）肝静脉扩张并管壁增厚，肝静脉内有大量的炎性细胞参杂在红细胞中 （图2-A），呈现局域性静脉窦扩张 （图2-B），肝细胞颗粒变性，部分胰腺组织静脉扩张，血管壁增厚，仅见2号和10号病鱼出现胰腺组织浓缩 （图2-C）和坏死（图2-D），其他肝胰腺组织结构基本正常，结合现场情况推断，是由于食用大量酒糟，醛、醇类有毒物质进入血液中引起的肝胰腺组织病变，但其对本病的不良影响不大。
脾组织：锦鲤脾脏红髓、白髓分辨不清，全部样品 （1～10号）脾组织的血管扩张、管壁增厚、血管外围实质组织凝固变性 （图2-E），且呈现一致的病变特征，部分患病个体 （1、8、9号）脾组织血管扩张，可见大量红细胞，部分红细胞坏死且呈黄泡泡状 （图2-F），甚至部分患病个体 （8号）凝固变性区域内组织坏死 （图2-G），可以诊断，脾组织的明显病变会严重影响脾造血、储血和免疫功能，对患病锦鲤的危害最大。
肾组织：全部样品中肾组织血管扩张、管壁增厚，血液红细胞中聚集较多炎性细胞 （图2-H），肾组织间质区域明显淤血，部分肾小管上皮细胞变性 （图2-I），头肾病变较中肾轻微。大部分头肾与中肾实质组织结构基本正常，可以诊断肾组织有病变，但其对本病的不良影响不大。
心组织：3和6号病鱼心肌纤维结构基本完好，静脉扩张，其中血液红细胞和炎性细胞凝结成血栓 （图3-A），8和9号病鱼肌束间充血严重（图3-B），其他样本的心组织结构正常。
肠组织：3号和10号病鱼肠绒毛末端充血严重，绒毛有部分末端坏死甚至脱落 （图3-C），9号病鱼杯状细胞分泌亢进 （图3-D），其他样本肠道绒毛结构正常。
图3 患病锦鲤心脏、肠道、鳃、病灶组织病理变化
Fig.3 Histopathological changes in the heart，intestine，gill and muscle lesions of sick koi carp
注：A为3号病鱼心脏血液红细胞和炎性细胞凝结成血栓 （↑）（×200）；B为9号病鱼肌束间充血严重，炎性细胞浸润 （⇧）（×200，小图×400）；C为3号病鱼肠绒毛末端充血严重 （⇧），部分绒毛末端坏死 （▲）（×200）；D为9号病鱼肠绒毛末端充血 （⇧），杯状细胞分泌亢进 （↑）（×200，小图×400）；E为6号病鱼鳃小片淤血呈气球状 （⇧）（×200）；F为2号病鱼病灶表皮和真皮组织区域大量淤血、炎性细胞浸润聚集 （
）、肌束坏死 （▲），病灶开始表现出淤血和炎症 （×100，小图×400）；G为6号病鱼病灶肌束溶解 （↑）（×200）；H为4号病鱼病灶肌束溶解 （↑）和坏死，形成部分空洞 （▲）（×200）；I为3号病鱼病灶肌肉组织大面积坏死，呈蜂窝状，内含炎性细胞 （▲）（×200，小图×400）；J为正常锦鲤肠道组织 （×100）；K为正常锦鲤心肌组织 （×200）；L为正常锦鲤肌肉组织横切 （×400）
Note：A，red blood cells and inflammatory cells are condensed into the thrombus in heart（↑）in sample No.3（×200）；B，muscle interstitial serious congestion，inflammatory cell infiltration（⇧）in sample No.9（×200，inserted Fig.×400）；C，the end of intestinal villi showing serious congestion（⇧）and necrosis（▲）in sample No.3（×200）；D，serious congestion（⇧）and goblet cell hypersecretion（↑）at the end of intestinal villi in sample No.9（×200，inserted Fig.×400）；E，gill filament branch showing balloon extravasated blood（⇧）in sample No.6 （×200）；F，lesions in the epidermis and dermis area showing extravasated blood，inflammatory cell infiltration（）and muscle fascicle necrosis（▲），lesions begin to show inflammation in sample No.2（×100，inserted Fig.×400）；G，muscle lesions are dissolved（↑）in sample No.6 （×200）；H，muscle lesions are dissolved（↑）and showing necrosis（▲）in sample No.4（×200）；I，muscle lesions showing severe cellular necrosis and inflammatory cells（▲）in sample No.3（×200，inserted Fig.×400）；J，normal intestinal tissue（×100）；K，normal myocardial tissue（×200）；L，transverse section of normal muscle tissue（×400）
鳃组织：仅见1号和6号病鱼鳃小片末端呈现气球状鳃淤血现象 （图3-E），部分鳃组织增生，但其对本病的不良影响不大，其他样本的鳃组织结构正常。
体表溃疡病灶组织：典型病变表现为病灶区域出现大量淤血，肌间大量炎性细胞浸润并聚集，组织横切面观察到肌纤维与肌内膜分离，肌束呈现明显的炎症、溶解、坏死等病变过程。病灶病程变化规律为：淤血和轻微炎症 （图3-F）、肌束溶解和炎症 （图3-G）、肌束溶解、炎症和坏死 （图3-H）、全部坏死 （图3-I）。此过程可以诊断是由致病菌局部感染而产生的病变和炎症反应，最后导致溃疡。也未见败血症和菌血症的组织病理变化特征，可以诊断为无全身性感染，属局部感染类型。
3 讨论
3.1 锦鲤体表溃疡是局部性感染并形成慢性病程
从本研究结果可以看出，溃疡病灶的临床表现规律性以及随着病情发展的演变，在组织水平上更加清楚地展示了病灶局部感染的炎症、变性和坏死的组织病理变化过程，这个炎症反应是较缓慢和局部的，未见到败血症和菌血症等全身性感染，该病的病原菌与滑行细菌引发的溃疡病［11］略有不同。患病个体感染和病情发展缓慢且病程较长，病鱼慢性死亡情况也符合这样的诊断，患病鱼体未发现寄生虫寄生，结合病理结果、现场发病情况和革兰氏染色发现，阴性短杆菌为优势菌，该菌是否是病原还有待进一步研究。由此作者推断，由于该养殖场长期投喂酒糟代替全价饲料，越冬后鱼体体质较弱，期间的转池、拉网等操作引起外伤，加之管理不当，水环境的变化及恶化引发病原菌侵入皮肤组织，从而感染引发溃疡病。
3.2 锦鲤脾凝固变性为食源性的病因
本病例全部样品均有不同程度的脾凝固变性、肝组织淤血、肾组织间质充血及其组织中血管扩张、管壁增厚、炎性细胞浸润的病理变化，对同池体表正常病鱼的研究发现，均有不同程度的相同病变，因此，该变化和体表溃疡病变可能无直接关联。经过调查推断，此病理变化与采用低质饲料可能有关，该养殖场长期用酒糟代替全价饲料，其中的醇、醛类有毒物质长期作用引起鱼类慢性中毒，虽然低含量的玉米等酒糟和其他动物蛋白源饲料搭配，可提高某些鱼类的饲料转化率，但饲料中替代豆粕、米糠的酒糟含量在高于30%的条件下不仅会降低鱼类的饲料转化率［18］，还能够显著降低草鱼、鲤等鱼类的生长性能［19］，而该患病锦鲤酒糟的投喂量远远高于此比例，估计是造成脾凝固变性等病变的主要原因。
3.3 脾凝固变性和溃疡病对患病锦鲤的病死联系
本病例的病程较长，持续了3～4个月，期间陆续有患病锦鲤死亡，死亡个体均患溃疡较严重且多出现溃疡空洞、内脏暴露。研究结果表明，病例有脾凝固变性、肝淤血、肾组织充血等病变，但内脏病变程度相对较轻且与溃疡严重程度并不一致，由此推断，其是锦鲤致死的次要原因，但会加速溃疡病病情的发展，病原菌的感染也加重了组织器官进一步病变，两者共同作用并引起病鱼死亡。从病鱼的临床症状观察，体表溃疡逐渐严重，遍及全身，溃疡面大而深，坏死溃烂，体壁穿透，内脏和组织暴露，水浸入体腔导致体内环境严重失衡［20］等是锦鲤致死的主要原因。
参考文献:
［1］ 李梅，刘文利，黄树涛，等.锦鲤嗜水气单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究［J］.中国预防兽医学报，2010，32（8）：591-594.
［2］ 韩娜娜，刘万建，耿伟光，等.锦鲤摩氏摩根氏菌的分离鉴定与药敏性研究［J］.中国预防兽医学报，2013，35（9）：729-732.
［3］ 李焕荣，崔德凤，张耳，等.锦鲤致病性嗜水气单胞菌分离和药敏实验［J］.中国预防兽医学报，2002，24（3）：46-49.
［4］ 姜娜，马志宏，李铁梁，等.锦鲤溃疡病病原菌的分离及16S rRNA鉴定［J］.中国畜牧兽医，2012，39（2）：174-177.
［5］ 秦国民，张晓君，陈翠珍，等.锦鲤维氏气单胞菌感染症及其病原生物学特性研究［J］.安徽农业科学，2008，36（19）：8115-8117.
［6］ 肖正国，吴育新，程小明.一起温和气单胞菌引起的锦鲤体表溃疡病的报告［J］.中国人兽共患病杂志，1996，12（4）：14.
［7］ 陆小萏，邹为民，谭爱萍，等.锦鲤摩氏摩根氏菌的鉴定及致病性研究［J］.淡水渔业，2005，35（2）：3-5.
［8］ Goodwin A E，Merry G E.Are all koi ulcer cases associated with infection by atypical Aeromonas salmonicida？Polymerase chain reaction assays of koi carp skin swabs submitted by hobbyists［J］. Journal of Aquatic Animal Health，2009，21（2）：98-103.
［9］ Matoyama H，Hoshino M，Hosoya H.Pathogenicity of atypical Aeromonas salmonicida isolated from colored carp Cyprinus carpio suffering from a new ulcerative disease［J］.Fish Pathology（Japan），1999，34（4）：189-193.
［10］ Tripathi N K，Latimer K S，Gregory C R，et al.Development and evaluation of an experimental model of cutaneous columnaris disease in koi Cyprinus carpio［J］.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2005，17（1）：45-54.
［11］ Teruo Miyazaki，Saburoh S，Syuzo E，et al.Histopathological studies of gliding bacterial ulcer disease of the color carp（Cyprinus carpio）-III：the visceral organs［R］Tsu City：Mie University，1976.
［12］ Bretzinger A，Fischer-scherl T，Oumouna M，et al.Mass mortalities in koi carp，Cyprinus carpio，associated with gill and skin disease［J］.Bulletin of the European Association of Fish Pathologists，1999，19（5）：182-185.
［13］ Miyazaki T，Kageyama T，Miura M，et al.Histopathology of viremia-associated ana-aki-byo in combination with Aeromonas hydrophila in color carp Cyprinus carpio in Japan［J］.Diseases of A-quatic Organisms，2001，44（2）：109-120.
［14］ Mirzaei M，Khovand H.Prevalence of Argulus foliaceus in ornamental fishes［goldfish（Carassius auratus）and koi（Cyprinus carpio）］in Kerman，southeast of Iran［J］.Journal of Parasitic Diseases，2013，5（12）：1-3.
［15］ 陈翠珍，房海，葛慕湘，等.锦鲤弗氏柠檬酸杆菌的鉴定［J］.河北科技师范学院学报，2012，25（4）：21-25.
［16］ 谢汉荣，郑坚川.嗜水气单胞菌引起锦鲤溃疡病［J］.动植物检疫，1994，5（1）：27-28.
［17］ Pikulkaew S，Meeyam T，Banlunara W.The outbreak of koi herpesvirus（KHV）in koi（Cyprinus carpio koi）from Chiang Mai Province，Thailand［J］.Thai J Vet Med，2009，39（1）：53-58.
［18］ Coyle S，Najeeullah T.A preliminary evaluation of naturally occurring organisms，distillery by-products，and prepared diets as food for juvenile freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii［J］. Journal of Applied Aquaculture，1996，6（2）：57-66.
［19］ 钟广贤.玉米DDGS对草鱼、鲤鱼生长性能及体成分的影响［D］.长沙：湖南农业大学，2013.
［20］ 汪开毓，张国宁.鲤鱼穿孔病的病理学观察［J］.四川农业大学学报，1995，13（1）：107-110.
Histopathological observations of skin ulcers disease in koi carp Cyprinus carpio koi cultured in ponds
QU Ming-zhi，PAN Lian-de
（Key Laboratory of Exploitation and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）
Abstract：Histopathological and clinic observations of skin ulcers disease was conducted by conventional paraffin section preparation method in koi carp Cyprinus carpio koi cultured in ponds（No.1 and No.2）from Shanghai Chaoyang koi carp farms.The results showed that the typical lesions in ulcers were found including a large number of congestion，inflammatory cell infiltration，inflammation，degeneration and necrosis in muscle bundles.These pathological features were caused by local infection of the ulcer bacteria，without infection on the whole body. There were highly consistent pathological changes including vasodilation，blood wall thickening，peripheral parenchymal tissue，coagulation and degeneration in all samples.Some red blood cell necrosis was found in yellow bubble-shaped and degeneration area and coagulation necrosis deterioration was observed in splenic tissue，indicating that obvious lesions of spleen were caused by toxic substances in the blood，hematopoiesis and blood storage capabilities.Pathological changes were found to be less in hepatopancreas and kidney than those in the spleen，with normal intestines，heart，gills，head-kidney and other tissues.In summary，spleen solidification degeneration，hepatopancreas tissue congestion，congestion and renal interstitial tissue vasodilatation，and blood wall thickening were the same pathological changes in all samples，which were not involved in skin ulcer disease.
Key words：Cyprinus carpio koi；skin ulcer disease；spleen solidification degeneration；pathology
中图分类号：S941.1
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.008
文章编号：2095-1388（2016）01-0044-06
收稿日期：2015-04-17
基金项目：水产动物遗传育种上海市协同创新中心 （ZF1206）
作者简介：曲明志 （1988—），男，硕士研究生。Email：qumingzhi666@126.com
通信作者：潘连德 （1960—），男，教授。Email：ldpan@shou.edu.cn
