图1 病鱼临床症状
Fig.1 Clinical symptoms of sick fish
摘要：为了鉴定东北地区异育银鲫Carassiusauratusgibelio感染的病原体是否为洪湖碘泡虫Myxobolus honghuensis,在吉林省查干湖某异育银鲫养殖基地获取病鱼,采用病鱼体外观察、虫体形态学观察与可量形状测定,对该寄生虫进行了初步鉴定,并对该寄生虫的18S rDNA进行克隆、测序与生物信息学分析。结果表明:病鱼症状具有典型的碘泡虫感染特征;可量形状测定结果表明,虫体外观与尺寸均与洪湖碘泡虫接近;生物信息学分析表明,该虫的18S rDNA与GenBank中登录号为JF340216的洪湖碘泡虫同源性达到99.3%;系统发育树显示,与已知洪湖碘泡虫为同一进化分支,确定该病为洪湖碘泡虫感染。本研究中,首次报道了东北地区一例早期感染洪湖碘泡虫的异育银鲫病例,研究结果可为碘泡虫的防治提供参考。
关键词：异育银鲫;洪湖碘泡虫;鉴定
异育银鲫Carassius auratus gibelio是由方正银鲫为母本与兴国红鲤为父本杂交得到的一种重要经济鱼类,经过人工培育近30年,年产量近2亿t,全国范围内均有饲养,具有重要的经济价值。由于异育银鲫幼鱼对洪湖碘泡虫的侵袭缺乏抗性[1],因此,由洪湖碘泡虫引起的碘泡虫病严重影响了该经济鱼类的商品价值。洪湖碘泡虫Myxobolus honghuensis首次报道于洪湖市,而且南方地区为洪湖碘泡虫病的高暴发区,给南方淡水鱼养殖造成了巨大的经济损失。碘泡虫种类繁多,其属下的诸多种类碘泡虫均能引起鱼类寄生虫疾病,治疗的方法也不尽相同;此外,碘泡虫感染部位与引起的患病外观变化大同小异,而且不同种类的虫体外观又比较相似,在没有分子生物学数据作为佐证的前提下,形态学鉴定与发病外观观察不足以确诊病原[2]。目前,很多学者开始重视并研究这种寄生虫,早在1991年,Landsberg等首次报道了444种碘泡虫[3], 2005年 Erias等[4]报道了 744种,2006年 Lom等[5]报道了792种,2011年Molnár[6]报道了近850种碘泡虫。碘泡虫的种类繁多表明了这一属的物种具有多样性[7],同时给该病的诊断也带来了一定的困难。
近年来,通过免疫学方法对该病病原的检测已经有所研究。早在 2003年,Lu等[8]使用一种MAb2D12单克隆抗体对圆形碘泡虫不同发育期分别进行了ELISA、斑点免疫、间接免疫荧光抗体检测,均获得较高的阳性率,这表明使用单抗对黏孢子虫进行早期检测是可行的。张晋勇等[9]应用噬菌体展示技术成功获得一株对圆形碘泡虫可溶性抗原具有特异性结合能力的单克隆抗体PCAN-H69,对该抗体和其他几株筛选后的单克隆抗体进行竞争ELISA试验,表明只有该抗体拥有很高的抑制率(88.17%),证明这种抗体具有很强的特异性,适合用作早期感染的特异性诊断。贾洛等[10]研究了洪湖碘泡虫的免疫原性并研制了相关的多抗与三株单抗,经过试验证明,这些抗体均具有很强的诊断意义。这些研究表明,采用免疫学检测技术对黏孢子虫进行早期诊断是可行的。但由于黏孢子虫的种类繁多,种间的相似抗原较多,容易引起大量的交叉反应[11],影响检测结果的特异性,目前对该病的早期免疫检测仅停留在试验阶段。而采用分子生物学方法对碘泡虫的鉴定则显得更为精确可行[12],通过分析病原体的18S rDNA序列特异性,再与其他已知种类序列进行比对,并建立系统发育树,得到的生物信息学数据可为形态鉴定结果提供重要佐证[13]。
2015年6月初,由于东北地区气温升高降雨频繁,位于吉林省境内的查干湖某淡水鱼养殖基地有异育银鲫鱼苗出现游动乏力、摄食减少、浮头消瘦等现象。吉林农业大学动物科学技术学院重点实验室研究人员从该养殖基地采集病鱼,经过初步观察发现,病鱼眼球突出,鳃盖下近眼端位置的咽部充血肿大,可见白色肿块。该养殖基地水体混浊,水温为24.3℃,初步确定为寄生虫感染所致。为进一步诊断该病病原,笔者对虫体进行了形态学观察、可量形状测定、生物信息学分析,旨在为东北地区碘泡虫病的发现与防治提供科学依据。
1.1 材料
异育银鲫病鱼采自吉林省境内的查干湖某淡水鱼养殖基地,共20尾,体质量为5～10 g,暂养在吉林农业大学动物科学技术学院消毒水族室中。
1.2 方法
1.2.1 病鱼体外症状观察 观察病鱼整体发病状态。将病鱼鳃盖沿鳃弓线慢慢剪开,使整个鳃弓暴露在外,观察咽部病变状态。
1.2.2 虫体形态学观察及可量形状测定 参照Zhang等[14]的方法从异育银鲫鱼苗咽部采集碘泡虫的包囊,再将分离后的虫体进行固定保存[15],对虫体进行形态学观察[16],随机选取20个成熟孢子进行测量,使用装有微米标尺的奥林巴斯E-330显微镜数码照相机的奥林巴斯IX51显微镜进行测量与观察,获取成熟孢子的数字化照片与孢子尺寸数值。所得测量结果与Liu等[17]报道的洪湖碘泡虫进行对比,并参照照片绘制虫体图片。
1.2.3 虫体基因组提取及目的片段的克隆、测序
采用脑穿刺法迅速将鱼处死,将分离的包囊进行匀浆,采用蔗糖密度梯度离心法制得纯化的虫体[18],置于1.5 mL离心管中,加入500μL裂解液 (100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris pH 7.6,10 mmol/L EDTA,0.2%SDS)煮沸10 min,使大部分虫体脱壳后冷却至室温,再加入500μL新鲜的裂解液与20μL蛋白酶K(20mg/mL),55℃下水浴12 h以上,使用酚-氯仿-异戊醇法抽提基因组。使用的引物为碘泡虫18S rDNA通用引物 MX3/ MX5(CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA/CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT)。PCR反应体系: 10×buffer 2.5μL,引物 (20μmol/L)各0.5μL, dNTP(40μmol/L)1μL,模板DNA 2μL(100 ng),Ex Taq DNA聚合酶 (TaKaRa)0.2μL,最后加灭菌双蒸水使反应总体积为25μL(胶回收反应体系以上各试剂用量加倍,使终体积为50μL)。反应在Eppendorf AG 22331 Hamburg梯度PCR仪中进行,PCR反应程序:95℃下预变性5 min;95℃下变性30 s,63.7℃下退火复性30 s,72℃下延伸1 min,共进行35个循环;最后在72℃下再延伸10min,于4℃下保存。胶回收产物经过10 g/L琼脂糖充分分离后,切下目的条带使用AxyGen胶回收纯化试剂盒纯化后连接至PMD-18T载体中,经酶切鉴定后提交至上海生物工程股份有限公司进行测序,结果在GenBank上进行序列比对。
1.2.4 系统发育树分析 采用DNAStar Lasergene 7.1软件分析序列相应属性,采用 ClustalⅣ对GenBank中已知洪湖碘泡虫18S rDNA保守序列与本试验克隆的序列进行对比分析,应用MegAlign模块构建该分离株与15种常见碘泡虫的系统进化关系树,分析待鉴定碘泡虫与其他碘泡虫的系统进化关系。
2.1 病鱼体外症状观察
病鱼外观消瘦,体表粗糙,颜色苍白,黏液分泌较少,眼球外凸。鳍条和腹部鳞片等处有出血点与溃疡。鳃盖下鳃弓近眼端的咽喉部存在大片乳白色囊肿,囊肿质地较软易破,囊膜较薄,内含干酪样黏稠包囊液。病鱼症状详见图1。
图1 病鱼临床症状
Fig.1 Clinical symptoms of sick fish
2.2 虫体形态学观察及可量形状测定
孢子正面观呈梨形,缝面观呈梭形,拥有两个极囊,大小不一,少数存在尾突 (图2)。孢子的形态测量数据见表1,根据显微图绘制的模拟图见图3。
图2 虫体形态图
Fig.2 Themorphology of the parasite
注:A为光学显微镜下孢子形态 (×1000);B为单孢子经数码放大100倍的形态
Note:A,Spore morphology under a light microscope(×1000); B,A sporemagnified by 100 times by a digital zoom
2.3 生物信息学分析
克隆所得的片段大小约为750 bp(图4),测序结果显示,其大小为727 bp。Blast比对分析结果显示,与GenBank登录号为JF340216的洪湖碘泡虫的同源性达到99%。使用DNAStar中的ClustalⅣ对克隆片段与已知洪湖碘泡虫的基因序列进行比对分析,结果显示,同源性为99.3%,发现第697号碱基发生突变,第14号碱基处发生缺失,第704号位置增多一个碱基 (图5)。
图3 虫体模拟图
Fig.3 The simulated diagram of the parasite
图4 虫体18S rDNA PCR产物电泳图
Fig.4 The 18S rDNA electrophoretogram of the parasite
注:M为DNA分子质量标准;1为虫体18S rDNA扩增产物;2为阴性对照
Note:M,DL2000 DNA Marker;1,PCR product from the parasite 18S rDNA;2,Negative control
图5 虫体18S rDNA保守序列比对结果
Fig.5 The 18S rDNA conservative sequence alignm ent of the parasite
表1 待检寄生虫与洪湖碘泡虫显微测量数据对比
Tab.1 Themorphometric comparison of the parasite sam ple w ith Myxobolus honghuensis μm
采集地区 寄主 寄生部位 孢子长 孢子宽 大极囊长 文献来源collected areahostlocationspore lengthspore widthlarge polarreference sources capsule length吉林省松原 异育银鲫 咽 16.4±0.810.8±0.78.6±0.3本文市查干湖 (14.0～19.8)(8.8～12.0)(6.9～10.1)湖北市省洪荆湖州 异育银鲫 咽 (1 15 6. .1 9～±109..5 5)(9 1.00. 4～±1 01 .. 4 3)(7 8. .6 4～±100..4 2) Liu等[17]采集地区 大极囊宽 小极囊长 小极囊宽 极突长度 极丝圈数 孢子形状 文献来源collectedlarge polarsmall polarsmall polarintercapsularfilamentshapereference sources areacapsule widthcapsule lengthcapsule widthappendixturns吉林省松原3.4±0.58.1±0.33.1±0.41.0±1.8 7～8梨形 本文市查干湖(2.8～5.2)(6.5～9.8)(2.6～4.3)湖北市省洪荆湖州(3 3..09 ±～04 .. 2 5)(7 7..09 ±～09 .. 2 3)(2 3..87 ±～04 .. 3 1) 0.8±1.5 7～8 梨形 Liu等[17]
采用MegAlign模块构建的系统发育树显示,该碘泡虫分离株与GenBank中登陆号为JF340216的洪湖碘泡虫位于同一进化分支 (图6)。
图6 基于该寄生虫18S rDNA序列构建的系统发育树
Fig.6 Phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequence of the parasite
通过观察病鱼外观,得出发病症状与碘泡虫感染相同。经过对虫体的形态学分析,进一步得出该虫与洪湖碘泡虫的显微结构极为相似,其尺寸数据与洪湖碘泡虫也较为接近,可以初步诊断为洪湖碘泡虫感染。采用该虫的18S rDNA序列对其进行分子生物学分类研究与鉴定,基于18S rDNA序列建立的系统发育树分析,得出该虫与洪湖碘泡虫的遗传距离最为接近,位于进化树的同一分支,进一步确诊为洪湖碘泡虫感染。
碘泡虫早期感染较为隐蔽,常规的检测并不能充分确诊感染病原体[11]。在寄生虫领域内,应用分子生物学技术对病原进行详细分析在近些年颇为流行,得到的结果较为客观、可靠,尤其对于外观难以鉴别、品种繁多的黏孢子虫来说,可以作为鉴定试验中的有力证据,为常规的鉴定提供了重要的辅助手段[19]。洪湖碘泡虫多寄生于南方地区异育银鲫上,常引起大规模碘泡虫疾病。本实验室研究人员首次在东北地区确诊一例早期感染洪湖碘泡虫的异育银鲫病例,这表明洪湖碘泡虫可跨地域传播,并具有较强的环境适应能力。本研究中的鉴定结果可为东北地区碘泡虫的防治提供参考资料。
目前,对于碘泡虫的感染机制与生活史尚不清楚,对处于孢子期的虫体仍无有效的杀灭药物。但鱼类在发生疾病后,免疫系统会发生一系列应激反应,其中非特异性免疫系统是机体抵抗疾病的第一道防线[20]。因此,增强鱼类非特异性免疫力与感染的早期诊断对于该病的防治来说同样重要。笔者建议东北地区饲养异育银鲫时每年入春与入冬前期定期杀灭养殖池内的螺类与寡毛类中间宿主,改良水质,定期饲喂免疫增强剂,尽量将虫体遏制在感染的早期,并保持养殖环境良好,避免交叉感染。
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Identification and bioinformatics of pathogen Myxobolus honghuensis found in silver crucian carp Carassius auratus gibelio in Qagan Lake
Abstract：Morphology of diseased silver crucian carp Carassius auratus gibelio collected from a breeding base in Qagan Lake in northeast China was observed and morphometrics of a parasite weremeasured in the diseased fish. The parasite was identified by cloning,sequencing and bioinformatics of 18S rDNA.The results showed that the diseased fish had the typical symptoms ofmyxobolus infection,specially similar to Myxobolus honghuensis in shape and dimensions.Biological information analysis revealed that there was 99.3%similarity of the 18S rDNA sequence between this parasite and Myxobolus honghuensis(GenBank:JF340216).Phylogenetic tree indicated that this parasite and Myxobolushonghuensis were clustered into the same evolutionary branch,confirming that the infection was caused by Myxobolus honghuensis.The findingswere the first report an early infection of Myxobolus honghuensis in northeast China and provided referenceswith the prevention and treatment ofmyxobolus.
Key words：Carassius auratus gibelio;Myxobolus honghuensis;appraisal
中图分类号：S941.5
文献标志码：A
收稿日期：2015-07-29
基金项目：国家现代农业产业技术体系 (CARS-46-29);吉林省公益性科研院所行业科研项目;吉林省自然科学基金资助项目(20140101035JC)
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2015.05.011
文章编号：2095-1388(2015)05-0509-05