银鲫与普通鲫早期胚胎发育的比较研究

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江哈尔滨150070)

摘要：为了解黑龙江水系银鲫Carassius auratus gibelio和普通鲫C.auratus auratus的胚胎发育过程,对银鲫(3n♀×3n♂,SS)和普通鲫 (2n♀×2n♂,DD)的胚胎发育过程进行了比较观察。结果表明:SS(DD)成熟的卵子呈浅黄色,卵膜透明,圆形,有黏性,卵径为1.3～1.7 mm(1.2～1.6 mm);水温为 (23± 1)℃条件下,SS(DD)受精后1 h 08 min(1 h 03 min)进入卵裂期,受精后2 h 54 min(5 h 02 min)进入囊胚期,受精后8 h 06 min(6 h 49 min)进入原肠胚期,受精后10 h 25 min(10 h 51 min)进入神经胚期,受精后14 h 22 min(16 h 20 min)进入器官形成期,59 h 31 min(59 h 05 min)后出膜。研究表明,SS和DD均具有正常的早期胚胎发育过程,这为进一步了解SS和DD的遗传背景和生殖方式提供了生物学依据。

鲫Carassius auratus主要分布于亚洲和欧洲。中国的银鲫主要分布于黑龙江流域和新疆等地,在其他水域也发现有染色体数为150～166的云南高背鲫、淇河鲫、彭泽鲫、普安鲫等三倍体种群。沈俊宝等[1]依据形态学和染色体数目将黑龙江水系的鲫分为两个亚种:一个是染色体数目为100的鲫亚种,主要分布于江河;另一个是染色体数目为150左右的银鲫,主要分布于大型湖泊水库。银鲫具有雌核发育和两性生殖两种生殖方式。银鲫卵子与异源精子受精行雌核发育,而与同源精子受精则行两性生殖[2-5]。关于银鲫的起源与进化,目前有两种观点:一种认为银鲫是二倍体鲫与鲤杂交而来的[6-7];另一种认为黑龙江银鲫是在特殊地理和环境下 (冰封等),由二倍体鲫进化而来的,是二倍体鲫在特殊环境下对不良环境的一种适应结果[1]。孙效文等[8]报道了银鲫与普通鲫存在着明显的遗传物质交流,较高的遗传相似性不仅与传统的银鲫起源于普通鲫的观点一致,也暗示银鲫与普通鲫存在经常性的遗传物质交流。但有关黑龙江水系银鲫和普通鲫胚胎发育的研究至今尚未见报道。本研究中,对黑龙江水系银鲫Carassius auratus gibelio(3n♀×3n♂)和普通鲫C.auratus auratus(2n♀×2n♂)的胚胎发育过程进行了比较观察,旨在为进一步了解该鱼的遗传背景及其生殖方式提供生物学依据。

1 材料与方法

试验用银鲫和普通鲫由黑龙江水产研究所松浦试验站提供。银鲫体长为29.2 cm,体质量为660 g;普通鲫体长为20 cm,体质量为190 g。染色体倍性经流式细胞仪检测确定,银鲫为三倍体,普通鲫为二倍体。

1.2.1 人工催产及授精选取发育良好的黑龙江水系银鲫和普通鲫进行催产,注射A2+DOT[雌性注射剂量:A2为4μg/kg(体质量),DOT为1 mg/kg(体质量),雄性减半],水温为 (23± 1)℃,效应时间为6～7 h,确认排卵后,轻压腹部采卵到直径9 cm的培养皿中,雄鱼同样轻压腹部用毛细管采精。干法授精,配制2n♀×2n♂(DD)和3n♀×3n♂ (SS)杂交组合。

1.2.2 幼鱼培育幼鱼培育温度为 (23±1)℃,每天两次更换曝气水,及时挑出死卵。

1.2.3 胚胎发育观察受精后按照各个发育时期定期取样,每个时期取样30个,发育时序以50%的胚胎发育至某个时期的时间计算,用LY-WNHPCCD进行显微观察及拍照。

在原肠晚期统计受精率,即受精卵数占总卵数的百分比。在孵出前期统计孵化率,即孵化出的苗数占受精卵总数的百分比。孵化出7 d时统计成活率,即成活胚胎占受精卵总数的百分比。采用SPSS 15.0软件进行显著性检验,显著性水平设为0.05,极显著性水平设为0.01。

2 结果与分析

2.1 不同时期的发育特征

在培育水温为 (23±1)℃时,黑龙江水系银鲫和二倍体鲫的胚胎发育时序可分为6个阶段共25个时期。

2.1.1 受精卵 SS(DD)成熟卵子呈浅黄色,圆形,有黏性,卵质分布均匀,卵径为1.3～1.7 mm (1.2～1.6 mm)。卵子受精后卵膜吸水膨胀,卵周隙明显扩大 (表1,图1-A,图2-A)。SS(DD)受精后50 min(39 min),卵子细胞质向动物极集中,逐渐隆起,形成胚盘,约占卵球高度的1/3 (表1,图1-B,图2-B)。

2.1.2 卵裂期 SS(DD)受精后1 h 08 min(1 h 03 min),卵子动物极出现裂纹,胚盘纵裂成2个大小相似的分裂球,为2细胞期 (表1,图1-C,图2-C);受精后1 h 18 min(1 h 25 min),出现第二次卵裂,沿第一次分裂垂直的方向进行第二次纵裂,形成4个大小相同的分裂球,进入4细胞期(表1,图1-D,图2-D);受精后1 h 21 min(1 h 57 min),胚盘进行第3次纵裂,分裂沟与第1次平行且位于其两侧,形成8个分裂球,排成两行,中间4个大,两侧4个小,进入8细胞期 (表1,图1-E,图2-E);受精后1 h 33 min(2 h 10 min),胚盘进行第四次纵裂,在第二次分裂面的两侧分别产生与之平行的分裂沟,形成大小相近的16个细胞,胚盘进入16细胞期 (表1,图1-F,图2-F);受精后1 h 59min(3 h 20min),胚盘进行第五次纵裂,形成32个大小不等的细胞,细胞排列不规则,边缘的细胞略大,胚盘进入32细胞期 (表1,图1-G,图2-G);受精后2 h 10 min (4 h 03 min),卵裂向多个方向进行,细胞数量逐渐增多,细胞界限分辨不清,分裂球越来越小,进人多细胞期 (表1,图1-H,图2-H)。

2.1.3 囊胚期 SS(DD)受精后2 h 54 min(5 h 02 min),细胞继续分裂,分裂球越来越小,分裂沟模糊不清,胚盘高耸于卵黄上方,占卵的1/2,进入囊胚早期 (表1,图1-I,图2-I);受精后2 h 59 min(5 h 48 min),细胞继续分裂,囊胚细胞开始向下方扩展而变得稍扁平,囊胚层较囊胚早期为低,已看不清细胞界限,进入囊胚中期 (表1,图1-J,图2-J);受精后4 h 24min(6 h 13min),胚层继续向下扩展,开始产生下包作用,此时胚盘变成弓状,进入囊胚晚期 (表1,图1-K,图2-K)。

2.1.4 原肠期 SS(DD)受精后8 h 06 min(6 h 49 min),囊胚层细胞继续下包卵黄1/3且内卷形成胚环,进入原肠早期 (表1,图1-L,图2-L);受精后8 h 52 min(8 h 31 min),囊胚下包卵黄1/ 2,进入原肠中期 (表1,图1-M,图2-M);受精后10 h 10 min(9 h 37 min),囊胚下包卵黄2/3,进入原肠晚期 (表1,图1-N,图2-N)。

2.1.5 神经胚期 SS(DD)受精后10 h 25 min (10 h 51 min),胚层细胞继续下包约4/5,胚孔尚未闭合,胚环明显缩小,进入神经胚期 (表1,图1-O,图2-O);受精后11 h 28 min(13 h 17 min),胚孔闭合,胚体呈弧形,胚盘完全包裹卵黄,进入胚孔封闭期 (表1,图1-P,图2-P)。

2.1.6 肌节出现及尾泡形成阶段 SS(DD)受精后13 h 18 min(13 h 42 min),胚孔封闭后躯干中段出现2对肌节,进入肌节出现期 (表1,图1-Q,图2-Q);受精后13 h 30 min(13 h 44 min),可观察到4对肌节,胚体尾部上出现圆形亮点,即尾泡,进入尾泡形成期 (表1,图1-R,图2-R)。

2.1.7 器官形成期 SS(DD)受精后14 h 22min (16 h 20 min),脑已分化为前、中、后3部分,前段透明囊泡为眼囊,进入眼囊期 (表1,图1-S,图2-S);受精后16 h 57min(16 h 15min),眼囊前倾,在其下方可观察到暗色斑块状的嗅囊,即进入嗅囊出现期 (表1,图1-T,图2-T);受精后17 h 03 min(17 h 41 min),尾部变圆,出现锥形尾芽,进入尾芽出现期 (表1,图1-U,图2-U);受精后18 h 10 min(18 h 54 min),出现透明的泡状耳囊,进入耳囊形成期 (表1,图1-V,图2-V);受精后21 h 05 min(22 h 37 min),可观察到22对肌节,胚体的中段出现不连续性的肌肉收缩,进入肌肉效应期 (表1,图1-W,图2-W);受精后24 h 40 min(27 h 47 min),心脏原基开始有节律的跳动,进入心跳期 (表1,图1-X,图2-X)。

2.1.8 出膜阶段 SS(DD)受精后59 h 31 min (59 h 05min),尾部开始出现,与体轴形成一条直线,头部仍然在卵膜内,进入出膜期 (表 1,图1-Y,图2-Y)。

2.2 银鲫和普通鲫的受精率及孵化率

由表2可知,银鲫和普通鲫的平均受精率分别为 65.90%、89.21%,平均孵化率分别为48.89%、77.58%。银鲫和普通鲫的受精率、孵化率和7日成活率均有极显著性差异(P＜0.01)。

3 讨论

3.1 银鲫与普通鲫的生殖方式

在黑龙江水系中存在两种鲫,一种为三倍体银鲫,另一种为二倍体普通鲫。黑龙江水系的银鲫与日本和东欧的银鲫一样,是一个天然雌核发育种群[9-10],因而所产生的后代与母本相似。二倍体普通鲫须通过雌雄两性配子的结合才能够繁殖后代,雌、雄比例正常[11]。雌核发育银鲫的另一个特殊现象就是在天然群体中,有5%～20%的雄性个体产生,而且雄性个体的比例与精子的来源密切相关。蒋一珪等[12]发现,异源精子产生的后代全为雌性,精子的亲缘关系越近,雄性的比例就越大。用亲缘越近的精子受精,精子的解凝程度越大,父本遗传物质进入子代就越多,子代中雄鱼也就越多。这与银鲫的异精效应 (父本的性状会在银鲫子代中有一定的体现)应该是同一个原理。杨洁等[11]研究表明,三倍体银鲫的精巢能够发育成熟,能产生正常的精子。据报道银鲫具有双重生殖方式,即雌性生殖和有性生殖。当银鲫卵子与异源精子受精时,产生与母本性状完全一致的全雌后代;而当银鲫卵子与同源精子受精时,卵子进行有性生殖,产生具有父母本遗传物质的雌性和雄性后代[13]。本研究结果也证实,银鲫卵子与银鲫精子能正常受精,并且具有正常的早期胚胎发育过程。

3.2 银鲫与普通鲫胚胎发育的比较

近年来,国内有关鱼类胚胎发育的研究已有不少报道,主要集中在中国特殊的鱼种和经济鱼种。而对鲫的胚胎发育鲜有报道。如表3所示,早在20世纪50年代,李璞等[14]报道了鲫和红鲫的胚胎发育速度及时序相同,在 (24.5±1)℃恒温条件下,从受精卵开始到孵化历经65 h。王冬武等[15]报道了芙蓉鲫受精卵胚胎在21～23℃水温条件下, 65 h开始出膜。梁正其等[16]报道了普安银鲫胚胎发育过程可分为23个发育期,水温18℃时需98.72 h出膜,水温24、26℃时分别需要56.30、48.2 h出膜。本研究中,对银鲫及普通鲫的早期胚胎发育进行观察比较,结果表明,银鲫与普通鲫的胚胎发育在外观上无明显差异,胚胎发育正常,发育时序基本相同。但从受精卵到胚盘形成银鲫比普通鲫慢,到卵裂期银鲫明显比普通鲫快。在(23±1)℃水温下,从受精到孵化,银鲫和普通鲫历经时间分别为59 h 31 min和59 h 05 min,二者差别不明显,但明显比芙蓉鲫快。分析原因一方面与温度有关,另一方面可能是不同种类胚胎发育速度不同所致。银鲫和普通鲫的受精率、孵化率和7日成活率均有极显著性差异 (P＜0.01),由此可认为,银鲫染色体组数目的增加,对受精率、孵化率和7日成活率有一定的影响。

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Com parative observation of embryonic development of silver crucian carp Carassius auratus gibelio and crucian carp Carassius auratus auratus

MA Hai-yan1,ZHOU He1,GAO Yang-chun1,SUN Xiao-wen2, LU Cui-yun2,CAO Ding-chen2,JIANG Zhen-hua1
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China)

Abstract：Themorphological characteristics of embryonic developmentwere observed in diploid crucian carp Carassius auratusauratus(2n♀×2n♂,DD)and silver crucian carp C.auratusgibelio(3n♀×3n♂,SS)in Heilongjiang River.The SS(DD)had yellow round adhensive mature eggs with transparentmembrane,and egg diameter of 1.3-1.7 mm(1.2-1.6 mm).The fertilized eggs from SS(DD)developed into cleavage stage 1 h 08 min(1 h 03 min)after fertilization at(23±1)℃.At the same conditions,blastula stage appear 2 h 54 min(5 h 02 min)after fertilization,gastrula stage appear 8 h 06 min(6 h 49 min)after fertilization,neurula stage was observed 10 h 25 min(10 h 51 min)after fertilization,organogenesis stage was noticed 14 h 22 min(16 h 20 min)after fertilization, and hatching stage was observed 59 h 31 min(59 h 05 min)after fertilization.The findings indicated that SS and DD had normal early embryonic development,provided an evidence to understand the genetic background and reproduction for SS and DD.

Key words：Carassius auratus gibelio;Carassius auratus auratus;embryonic development

基金项目：淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室开放课题 (NLJEL-FFB-01)

作者简介：马海艳 (1990—),女,硕士研究生。E-mail:724479732@qq.com

通信作者：周贺 (1985—),女,博士,讲师。E-mail:zhouhe@dlou.edu.cn