表1 正交试验因素水平表
Tab.1 Factor and level table in an orthogonal test factors
摘要：岩藻聚糖硫酸酯是一种广泛存在于褐藻中的水溶性杂多糖,具有多种生物活性。为研究萱藻岩藻聚糖硫酸脂的保肝护肝作用,以大连沿海的新鲜萱藻Scytosiphonlomentaria为原料,利用复合酶解法提取萱藻中的岩藻聚糖硫酸酯,并用正交试验法优化提取工艺。结果表明:复合酶解法的最佳工艺参数为酶加量2.95%、酶解温度50℃、pH值5.5、酶解时间60min,在此条件下岩藻聚糖硫酸酯的提取率为4.28%;萱藻岩藻聚糖硫酸酯对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保肝试验显示,萱藻岩藻聚糖硫酸酯可显著抑制小鼠血清中AST、ALT、LDH活性和肝脏MDA含量的升高,显著提高肝脏GSH含量和SOD活性。研究表明,萱藻中岩藻聚糖硫酸脂具有显著的保肝护肝作用。
关键词：萱藻;岩藻聚糖硫酸酯;提取工艺;保肝护肝
萱藻Scytosiphonlomentaria隶属于褐藻门,广泛分布于中国辽东半岛到海陵岛之间的沿海地区,属于温带性海藻[1]。萱藻藻体的生长方式为单条丛生,每条长度为15～70cm,在幼体时藻体为实心,长到成体时变成空心,藻体呈节状,是一种重要的海藻资源[2]。
据报道,萱藻中含有岩藻聚糖硫酸酯[3-5],岩藻聚糖硫酸酯具有降血脂、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血糖等多种生物活性物质[3-9]。本研究中,采用正交试验法对萱藻中岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺进行优化,并研究其保肝护肝作用,旨在为萱藻的高效综合利用提供科学依据。
1.1 材料
新鲜萱藻购自大连市黑石礁市场。清洁级昆明小鼠购自大连医科大学动物实验中心。
纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶均购自上海蓝季科技发展有限公司,山梨醇购自天津市光复精细化工研究所,联苯双酯滴丸购自北京协和药厂。乙醇为95%(体积分数,下同)的食用乙醇,其他试剂均为分析纯。谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨酶 (ALT)、乳酸脱氢酶 (LDH)、丙 二醛(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、微量还原型谷胱甘肽 (GSH)和蛋白定量测试盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 萱藻水分的测定 参照 GB/T5009.3—2003[10],采用直接干燥的方法测定水分含量。
1.2.2 岩藻聚糖硫酸酯提取工艺的优化 准确称取萱藻,加入至萱藻干基18倍的水,用高速组织捣碎机捣碎,使用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶(三者的质量比为4∶3∶2),在不同的加酶量、酶解时间、pH和酶解温度下进行酶解,然后将其置于沸水中抽提2h,降至室温后离心,得上清液。在上清液中加入乙醇,至乙醇含量为20%,离心,去掉溶液中的絮状沉淀,得上清液;在该上清液中加入乙醇,至乙醇含量为60%,产生白色沉淀后,
离心得到沉淀,即为岩藻聚糖硫酸酯粗产品。将得到的岩藻聚糖硫酸酯粗产品加水溶解,在溶液中加入乙醇至乙醇含量为30%,溶液中产生少许不溶物,离心除去不溶物,得上清液;再加入乙醇,至乙醇含量为70%,溶液中有白色沉淀产生时,用无水乙醚洗涤沉淀,经冷冻干燥得白色粉末即为岩藻聚糖硫酸酯粗提物[11]。
1.2.3 硫酸根和多糖含量的测定 采用盐酸水解-硫酸钡重量法测定硫酸根含量[12],采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[13]。
1.2.4 岩藻聚糖硫酸酯对四氯化碳 (CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用 将60只体质量为(18±2)g的清洁级雌性昆明小鼠,随机分为6组:空白对照组、CCl4模型组、联苯双酯阳性对照组[剂量为300mg/(kg·d)]、萱藻岩藻聚糖硫酸酯(F)低剂量组[100mg/(kg·d)]、F中剂量组[300mg/(kg·d)]、F高剂量组[500mg/(kg· d)],每组放10只小鼠。连续10d给小鼠饲喂基础饲料,然后对阳性对照组和F剂量组小鼠进行灌胃,每只每天灌胃规定剂量。末次灌胃2h后,给空白对照组小鼠腹腔注射植物油,给其他5组小鼠按 10mL/kg(体质量)的剂量腹腔注射含0.4%CCl4的植物油溶液[9]。小鼠禁食24h后,从眼球取血,脱颈处死小鼠,取肝脏称重。血液经3000r/min离心15min得到上清,用试剂盒测定AST、ALT、LDH活性。肝脏取相同部位约0.3g,加入冰生理盐水进行匀浆,配制成10%肝组织匀浆液,剩余的肝脏放入甲醛中浸泡,制成肝切片后用显微镜进行观察。用试剂盒测定肝脏匀浆液中的GSH、MDA、SOD值,并计算肝脏指数:
肝脏指数=肝脏质量 (mg)/体质量 (g)。
1.3 数据处理
试验数据以平均值±标准差表示。用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,用Duncan法进行多重比较,显著性水平设为0.05,极显著性水平为0.01。
2.1 萱藻水分
利用直接干燥法测得新鲜萱藻的水分含量为(90.62±0.003)%。
2.2 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺的优化
在料液比为1∶18(质量比)的萱藻水提取液中,加入纤维素混合酶,以岩藻聚糖硫酸酯的提取率 (提取率=岩藻聚糖硫酸酯/原料干质量× 100%)、硫酸根含量为指标,设计4因素3水平的正交试验L9(34),正交试验设计方案及试验结果见表1和表2。
表1 正交试验因素水平表
Tab.1 Factor and level table in an orthogonal test factors
因素factors水平level A酶加量/% quantity of enzyme B C D温度/℃temperature pH值pH value时间/min time 1 2.65 45 5.5 40 2 2.95 50 4.5 50 3 3.25 55 5.0 60
表2 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取的正交试验设计方案及试验结果
Tab.8 The design and results in the orthogonal test
试验号No. A/% B/℃ C D/min提取率/% extraction yield SO2-4含量/% content 1 1(2.65) 1(45) 1(5.5)1(40) 26 k2 4.95 5.38 3.97 3.73 k3 4.93 4.94 4.67 5.41 R 1.43 2.31 0.79 1.68 k′1 22.78 22.66 20.25 21. 2.22 25.89 2 1 2(50) 2(4.5)2(50) 3.20 22.83 3 1 3(55) 3(5.0)3(60) 5.14 19.62 4 2(2.95) 1 2 3 4.00 21.88 5 2 2 3 1 5.86 18.82 6 2 3 1 2 4.98 18.89 7 3(3.25) 1 3 2 3.00 20.20 8 3 2 1 3 7.08 15.97 9 3 3 2 1 4.70 20.06 k1 3.52 3.07 4.76 4. 59 k′2 19.86 19.21 21.59 20.64 k′3 18.74 19.52 19.55 19.16 R′ 4.04 3.45 2.04 2.43
由表2可知,以岩藻聚糖硫酸酯提取率为指标时,由R值得知,各因素的影响能力依次为酶解温度＞酶解时间＞酶加量＞pH,最优组合为A2B2C1D3;以SO2-4含量为指标时,由R′值得知,各因素的影响能力依次为酶加量＞酶解温度＞酶解时间＞pH,最优组合为A1B1C2D1。
从9组正交试验中得出提取率最优组为8号,即 A3B2C1D3,SO2-4 含量最优组为 1号,即A1B1C1D1。试验结果与用极差分析得到的理论值结果不一致,因此,分别对A2B2C1D3、A1B1C2D1和实际的最优组A3B2C1D3、A1B1C1D1进行验证试验,结果见表3。
表3 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取的正交试验验证结果
Tab.3 Verification test of the fucoidan extracting in an orthogonal experiment表3 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取的正交试验验证结果
Tab.3 Verificationtestofthefucoidanextractinginanorthogonalexperiment
试验组test group SO2-4含量/% content A2B2C1D34.28 26.04 A1B1C2D1 2.74 27.50 A3B2C1D3 6.81 16.22 A1 B1 C1 D1岩藻聚糖硫酸酯提取率/% fucoidan sulfate extraction yield SO2-43.16 24.09试验组testgroup SO2-4含量/% content A2B2C1D34.28 26.04 A1B1C2D1 2.74 27.50 A3B2C1D3 6.81 16.22 A1B1C1D1岩藻聚糖硫酸酯提取率/% fucoidansulfateextractionyield SO2-43.16 24.09
由表2可知,以岩藻聚糖硫酸酯提取率为指标时,由R值得知,各因素的影响能力依次为酶解温度＞酶解时间＞酶加量＞pH,最优组合为A2B2C1D3;以SO2-4含量为指标时,由R′值得知,各因素的影响能力依次为酶加量＞酶解温度＞酶解时间＞pH,最优组合为A1B1C2D1。
从9组正交试验中得出提取率最优组为8号,即 A3B2C1D3,SO2-4 含量最优组为 1号,即A1B1C1D1。试验结果与用极差分析得到的理论值结果不一致,因此,分别对A2B2C1D3、A1B1C2D1和实际的最优组A3B2C1D3、A1B1C1D1进行验证试验,结果见表3。
表3 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取的正交试验验证结果
Tab.3 Verification test of the fucoidan extracting in an orthogonal experiment表3 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取的正交试验验证结果
Tab.3 Verificationtestofthefucoidanextractinginanorthogonalexperiment
试验组test group SO2-4含量/% content A2B2C1D34.28 26.04 A1B1C2D1 2.74 27.50 A3B2C1D3 6.81 16.22 A1 B1 C1 D1岩藻聚糖硫酸酯提取率/% fucoidan sulfate extraction yield SO2-43.16 24.09试验组testgroup SO2-4含量/% content A2B2C1D34.28 26.04 A1B1C2D1 2.74 27.50 A3B2C1D3 6.81 16.22 A1B1C1D1岩藻聚糖硫酸酯提取率/% fucoidansulfateextractionyield SO2-43.16 24.09
从表3可见:提取率最高的组为A3B2C1D3,为6.81%,但是在此条件下SO2-4含量较低;SO2-4含量最高的组为A1B1C2D1,为27.50%,但是在此条件下提取率不高;综合考虑,A2B2C1D3组的提取率和硫酸根含量都接近最高值,所以确定A2B2C1D3组为最优组。因此,本试验中条件下,确定萱藻中岩藻聚糖硫酸酯的最佳提取工艺:料液比为1∶18,纤维素酶混合酶酶加量为2.95%,酶解温度为50℃,pH为5.5,酶解时间为60min,在此条件下,岩藻聚糖硫酸酯的提取率为4.28%, SO2-4含量为26.04%。
2.3 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯对CCl4造成的急性肝损伤小鼠生化指标的影响
2.3.1 小鼠血清中AST、ALT、LDH活性 从表4可见:注射CCl4后,与空白对照组相比,模型组小鼠血清中AST、ALT和LDH活性均极显著升高(P＜0.01),说明CCl4对小鼠的肝脏造成了破坏,建模成功;与模型组相比,灌胃岩藻聚糖硫酸酯的各剂量组和联苯双酯阳性组小鼠血清中的AST、ALT和LDH活性均极显著下降 (P＜0.01),但各剂量组与联苯双脂阳性组之间均无明显差异 (P＞0.05)。
表4 小鼠血清AST、ALT、LDH活性的变化 (n=10)
Tab.4 Changes in ALT,AST and LDH activities in m ice serum(n=10) U/L
注:同列中标有不同大写字母者表示组间有极显著性差异 (P＜0.01),标有不同小写字母者表示组间有显著性差异 (P＜0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异 (P＞0.05),下同
Note:Themeans with different capital letters within the same column are very significantly different at the 0.01 probability level,means with different letters being significantly different at the 0.05 probability level,and themeans with the same letters within the same column are not significant differences,et sequentia
LDH空白对照组 — 36.28±9.50Aa 23.33±11.76Aa 35.18±25.19组别group 剂量/(mg·kg-1·d-1) 谷草转氨酶AST 谷丙转氨酶ALT 乳酸脱氢酶Aa CCl4模型组 — 115.8±45.14Bb 108.5±44.03Bb 184.7±82.25Bb联苯双酯阳性组 300 37.05±17.94Aa 43.72±25.68Aa 71.94±29.68AaF低剂量组 100 37.37±22.91Aa 28.89±2.81Aa 66.31±37.69AaF中剂量组 300 39.10±12.29Aa 28.28±9.11Aa 57.20±31.47AaF高剂量组 500 36.63±17.30Aa 25.61±13.06Aa 56.89±30.06Aa
从表5中可见,注射CCl4后,与空白对照组相比,模型组小鼠肝组织中MDA含量和肝脏指数均极显著升高 (P＜0.01),GSH含量显著降低 (P＜0.05),SOD活性极显著降低 (P＜0.05),说明小鼠肝脏遭到破坏,建模成功;与模型组相比,灌胃岩藻聚糖硫酸酯的各剂量组和联苯双酯阳性组的MDA含量和肝脏指数均有降低,除联苯双酯阳性组、F低剂量组与模型组的肝脏指数无显著差异外(P＞0.05),其余组均与模型组的MDA含量及肝脏指数有显著性差异 (P＜0.05);SOD活性均显著升高 (P＜0.05),F低剂量组SOD活性的升高效果好于F高剂量组和F中剂量组,GSH含量均有升高,仅联苯双酯阳性组和F高剂量组与模型组有显著性差异 (P＜0.05)。这表明,萱藻岩藻聚糖硫酸酯对小鼠肝脏有显著的保护作用。
表5 小鼠肝脏MDA、GSH含量和SOD活性的变化 (n=10)
Tab.5 Changes in MDA and GSH contents,and SOD activity in livers of a m ice(n=10)
肝脏指数/(mg·g-1) hepatic-somaticindex空白对照组 — 12.39±3.01Aa 25.63±1.98Ab 7.40±0.44Bb 44.72±4.50组别group剂量/ (mg·kg-1·d-1)丙二醛MDA/ (nmol·mg-1)微量还原型谷胱甘肽GSH/ (μmol·g-1)超氧化物歧化酶SOD/ (U·mg-1) Aa CCl4模型组 — 24.82±5.94Bb 14.74±1.77Aa 5.80±0.70Aa 51.70±0.44Bc联苯双酯阳性组 300 17.94±3.59ABa 25.42±7.25Ab 6.85±0.31ABb 47.47±1.74ABabcF低剂量组 100 19.26±4.06ABa 23.04±6.63Aab 7.13±0.56ABb 49.48±0.61ABbcF中剂量组 300 18.44±3.22ABa 23.55±1.48Aab 6.90±0.58ABb 45.88±3.32ABabF高剂量组 500 16.83±5.06ABa 24.59±6.13Ab 6.95±0.58ABb 44.98±0.76ABab
综上所述,从萱藻中提取的岩藻聚糖硫酸酯可以抑制脂质过氧化,具有一定抗氧化和清除自由基的能力,可以提高GSH含量和SOD活性,具有显著的保肝护肝作用。
2.3.3 小鼠肝脏的组织学观察 从图1可以看出:空白对照组的肝小叶结构清晰,细胞完整,形态正常,可见清晰的细胞核;CCl4模型组的中央静脉周围细胞出现大面积坏死,细胞破裂成条状,细胞核消失,排列紊乱,说明小鼠肝脏遭到破坏,建模成功;与模型组相比,F低剂量组中央静脉周围的细胞坏死且明显减少,多数细胞完整,形态正常,细胞排列整齐,联苯双酯阳性组和F中剂量组、F高剂量组与空白对照组相近。从光学显微镜下观察到的组织学形态可以得出,萱藻中的岩藻聚糖硫酸酯对CCl4诱导的小鼠肝损伤具有显著的保护作用。
图1 光学显微镜 (400×)下CCl4致肝损伤的肝组织切片照片
Fig.1 A photom icrograph of(400×)injury liver induced by CCl4under a lightm icroscope
注:A为空白对照组;B为CCl4模型组;C为联苯双酯阳性组;D为F低剂量组;E为F中剂量组;F为F高剂量组
Note:A,blank control group;B,CCl4model control group;C,bifendate positive group;D,F low-dose group;E,Fmedian-dose group;F,F high-dose group
岩藻聚糖硫酸酯存在于海藻细胞的细胞壁基质中,添加的纤维素混合酶主要用于分解细胞壁。萱藻中富含果胶质、蛋白质,在浸提过程中会增加浸提液的黏稠度[14],使岩藻聚糖硫酸酯不易溶出。针对岩藻聚糖硫酸酯的以上特点,本研究中优化了萱藻中岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺,得到最优条件为料液比1∶18,纤维素混合酶酶加量为2.95%,酶解温度为50℃,pH为5.5,酶解时间为60 min。在此条件下,岩藻聚糖硫酸酯的提取率为4.28%,SO2-4含量为26.04%。
本试验中对CCl4造成的急性肝损伤小鼠模型研究结果表明,岩藻聚糖硫酸酯能够显著抑制小鼠血清中ALT、AST、LDH活性的升高以及肝组织中MDA含量、肝脏指数的升高,提高小鼠体内的SOD活性和GSH含量。与模型组相比,F中剂量组、F高剂量组小鼠肝脏指数显著降低,说明岩藻聚糖硫酸酯显著降低了由CCl4造成的急性肝损伤,根据小鼠肝损伤后的肝组织切片也可以得出此结论。
ALT主要存在于细胞浆中,AST主要存在于细胞浆的线粒体中。当细胞受到损伤时,ALT首先进入血液中,当细胞严重损伤危及线粒体时,AST也会进入血液中。LDH是糖酵解过程中一种重要的酶,任何原因引起的肝细胞损伤均可使LDH逸出,引起血清中LDH活力增加。MDA是膜脂过氧化的终产物之一,其含量的高低可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一,它的主要伤害是导致膜脂过氧化,损伤生物膜结构 (主要是细胞质膜),使得细胞膜结构和功能受到损伤,改变膜的通透性,从而影响一系列生理生化反应的正常进行。与模型组相比,F剂量组血清中ALT、AST、LDH活性均显著降低,肝脏中MDA含量显著降低,说明岩藻聚糖硫酸酯显著降低了由CCl4造成的小鼠急性肝损伤中肝细胞的损伤程度,并且降低了肝细胞膜的损伤。SOD是一种源于生命体的活性物质,能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。GSH为解除毒素的特效物质,是一种由三个氨基酸组成的小分子肽,为动物体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂。与模型组相比,F剂量组肝脏中SOD和GSH含量的显著升高,说明岩藻聚糖硫酸酯可能是通过增强小鼠的抗氧化能力,抑制自由基引起的脂质过氧化,从而保护肝脏免受损伤。
综上所述,萱藻中岩藻聚糖硫酸酯具有显著的保护肝脏作用,能显著降低由CCl4造成的急性肝损伤,降低肝细胞和肝细胞膜的损伤程度,作用机理可能是通过增强小鼠的抗氧化能力,抑制自由基引起的脂质过氧化,从而保护肝脏免受损伤。确切的作用机理还有待进一步探明。
参考文献：
[1] 李伟新,朱仲嘉,刘凤贤,等.海藻学概论[M].上海:上海科学技术出版社,1982:148-154.
[2] 高伟,宫相忠,张必达.环境因子对萱藻丝状体孢子放散的影响[J].海洋与湖沼,2012,43(2):244-248.
[3] 罗荣珺,李伟.褐藻多糖硫酸酯的研究进展[J].科技资讯, 2011,35:10.
[4] 曲桂燕.五种褐藻岩藻聚糖硫酸酯提取纯化及其功能活性的比较研究[D].青岛:中国海洋大学,2013.
[5] 逯慎杰,刘秀河,田宝兰.响应面分析法优化海带提取液制备工艺的研究[J].食品与发酵科技,2011,47(1):53-64.
[6] 孙海森.海带岩藻多糖硫酸酯的分离纯化及相关活性研究[D].杭州:浙江工商大学,2012.
[7] 罗荣君.褐藻多糖硫酸酯的制备及纯化[J].工业技术,2012, 21:83.
[8] 王景峰.萱藻岩藻聚糖硫酸酯的制备及其抗血栓活性的研究[D].青岛:中国海洋大学,2013.
[9] Wang Qiukuan,Song Yuefan,He Yunhai.Structural characterization of alga Costaria costata fucoidan and its effects on CCl4-induced liver injury[J].Carbohydrate Polymers,2014,107:247-254.
[10] 大连轻工业学院.食品分析[M].北京:中国轻工业出版社, 1994.
[11] 纪明侯.海藻化学[M].北京:科学出版社,1997:330-333.
[12] 张惠芬,李宝才,范家恒,等.盐酸水解-硫酸钡重量法测定硫酸酯化多糖硫酸基含量方法考察[J].食品科学,2002,28 (5):107-111.
[13] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:上海科学技术出版社,1987:6-7.
[14] 赵前程,滕钊,汪秋宽,等.复合酶法提取海带多糖的研究[J].沈阳农业大学学报:自然科学版,2007,38(2):220-223.
Optim ization of extraction and hepatoprotective activity of fucoidan from seaweed Scytosiphon lomentaria
Abstract：Fucoidan as a soluble heteropolysaccharide widely found in brown seaweed was extracted and optimized from fresh seaweed Scytosiphon lomentaria collected in Dalian coast in an orthogonal experiment by an enzymatic method.The results showed that the optimal extraction with crude fucoidan yield of 4.28%was conducted under the condition of the ratio of sample towater=1∶18,the addition of combined enzyme at a rate of2.95%,hydrolyzing temperature of 50℃,pH value of 5.5,and reaction for 60 min.The protective effect of the fucoidan on acute liver injury induced by CCl4was studied inmice.Itwas found that the fucoidan from the seaweed had significant inhibition of the activities of glutamic-oxalacetic transaminase(AST),alanine aminotransferase(ALT),and lactate dehydrogenase(LDH)and level ofmalondialdehyde(MDA).The reduced glutathione(GSH)contentand superoxide dismutase(SOD)activitywere found to be significantly increased,indicating that fucoidan from Scytosi+ phon lomentaria showed potential hepatoprotective effect.
Keywords：Scytosiphon lomentaria;fucoidan;extracting technology;anti-liver damage
中图分类号：R151
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2015.04.013
文章编号：2095-1388(2015)04-0417-05
收稿日期：2015-01-30
基金项目：国家自然基金面上项目 (31471610)