摘要:对广东佛山一突发批量急性死亡现象的大口黑鲈Micropterus salmoides养殖池塘中的患病大口黑鲈鱼种进行了研究。结果表明：濒死的大口黑鲈在水面漫游，烂身、烂鳍，停止摄食，严重者体色发黑;解剖病鱼鳃有少量出血点，肝脏严重肿大、充血，脾脏肿大，胃肠空虚，肾脏肿大；流行病学调查发现，该病具有明显的传染性；从病鱼肝脏、脾脏和肾脏中未分离到致病菌，也未检测到大量寄生虫；组织病理切片观察发现，肝脏、脾脏和肾脏均呈弥漫性坏死；参考GenBank中弹状病毒的基因序列，设计并合成检测引物，以从自然发病鱼提取的DNA 作为模板，检测结果显示，病鱼均能扩增出与预期大小片段相符的特异性产物；经过克隆测序比对显示，扩增条带的基因序列与杂交鳢弹状病毒(HSHV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)核苷酸序列同源性分别为96.9%、95.3%。因此，初步诊断引起大口黑鲈鱼种急性死亡的病原为弹状病毒。
关键词: 大口黑鲈；弹状病毒；诊断；组织病理变化
大口黑鲈Micropterus salmoides俗称加州鲈、黑鲈，隶属于鲈形目Perciformes、鲈亚目Porcoidei、太阳鱼科Cehtrachidae、黑鲈属Micropterus，原产于美国加利福尼亚州密西西比河水系，是一种肉质鲜美、抗病力强、生长迅速、易起捕的名贵肉食性鱼类。大口黑鲈的适温范围广，耐低氧能力强，喜欢栖息于沙质或沙泥质不混浊的静水环境中。
广东佛山于1983 年引进大口黑鲈，并于1985 年人工繁殖成功，鱼种被广泛养殖，均取得较好的经济效益。但随着养殖规模的不断扩大，大口黑鲈的病害问题日显突出，如烂鳃病、溃疡病、诺卡氏菌病、车轮虫病、虹彩病毒病等。近年来，广东佛山地区的养殖场经常暴发大口黑鲈鱼种大规模死亡的流行性疾病，造成了巨大的经济损失。
2014年6月，广东省佛山市伦教镇一口约0.47 hm2的大口黑鲈养殖池塘鱼种出现突发性死亡，发病第1天死亡20多尾，第2天死亡1000多尾，第3天死亡8000多尾，一周后死亡率达90%以上。本研究中，从寄生虫学、细菌学和病毒学三方面对该池塘中发病鱼进行分析，结合流行病学调查及分子生物学鉴定，确认引起大口黑鲈鱼种暴发性死亡的疾病为弹状病毒病，其病原为弹状病毒。
1.1 材料
研究用患病大口黑鲈鱼种于2014年6月取自广东省佛山市某养殖场一口大口黑鲈养殖池塘，共采集7尾濒临死亡的发病鱼。
2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，RNAiso Plus以及PrimeScript© RT reagent Kit购自宝生物工程(大连)有限公司，普通营养琼脂购自青岛海博生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 在GenBank中检索下载弹状病毒的基因序列，在其保守序列中设计一对特异性引物，引物序列如下：
上游引物P1为
5′ATAAGGGTAGTTGAGAAGAAG 3′；
下游引物P2为
5′CTTCTTGTTGCTCTTCTTAAA 3′。
预扩增片段长度为372 bp，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
1.2.2 流行病学调查及临床检查 对发病养殖池塘的水温以及发病鱼的鱼龄、苗种来源、传染性、发病率和死亡率进行调查，观察病鱼在养殖池中的活动情况。取发病鱼置于解剖盘中，观察体表症状，然后打开腹腔，观察内脏组织器官病变。
1.2.3 细菌检查 无菌条件下，使用普通培养皿，以平板划线法从患病鱼的肝、脾、肾等组织分离细菌，接种后运回实验室，置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察细菌的生长情况。
1.2.4 寄生虫检查 取病鱼鳃丝，采用水浸片法，即取一点鳃丝于载玻片上，加上一滴清水，用镊子将组织分散，加上盖玻片，稍加压平，再用显微镜观察寄生虫。
取病鱼血液，采用涂片法，即取一滴血液于载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察寄生虫。
取病鱼肝脏、肾脏、肌肉和肠道组织，采用压片法，即取少许组织于载玻片上，轻轻盖上另一载玻片，轻压使受检组织压成一透明薄片，然后在显微镜下观察寄生虫。
1.2.5 RNA的提取 分别取7尾鱼样品的肝、脾、肾组织器官，研磨后于-20 ℃下反复冻融3次备用。采取商业化的RNA抽提试剂RNAiso Plus，按照其说明书，抽提总RNA，用ddH2O溶解，于-20 ℃下保存备用。
1.2.6 RT-PCR检测及序列分析 取检测样品的RNA模板7 μL，加入PCR反应管中，再加入5×PrimeScript©Buffer 2 μL、PrimeScript© RT Enzyme Mix I 0.5 μL、Random 6 mers 0.5 μL，反应总体积为10 μL，充分混匀后，置于PCR仪上，于37 ℃下逆转录反应15 min，85 ℃下灭活逆转录5 s，得到cDNA产物。
采用引物P1和P2，PCR反应体系(共20 μL)：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，灭菌双蒸水6 μL，cDNA模板3 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反应程序：95 ℃下预变性5 min；95 ℃下变性30 s，55 ℃下退火30 s， 72 ℃下延伸30 s，共进行30个循环；最后在72 ℃下延伸10 min。于4 ℃下保存，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。
将目的条带纯化后，通过正反两次测序，测序结果与GenBank 中序列进行Blast 比对，从中选取部分相关序列，用ClustalX 软件分析序列同源性和构建系统进化树。
1.2.7 病理学研究 分别取患病鱼肝、脾、肾组织，经波恩氏液固定24 h，再经体积分数为70%、80%、90%、100%的酒精脱水，用二甲苯透明、石蜡包埋切片(5～6 μm)，再用苏木精-伊红(H.E)染色，在Nikon E800 显微镜下观察并拍照。
2.1 发病情况和流行病学
近年来，佛山地区人工养殖大口黑鲈苗种经常发生一种急性死亡的疾病，死亡量大，用抗菌药物无效，具有典型的传染性，多从一个地区传染到另外一个地区，同一地区也有相互传染的特点。本研究中，采样的发病池塘水温为30 ℃，水质指标正常，养殖的大口黑鲈鱼种开始死亡量小，之后死亡量突然增加，每天死亡近万尾，使用各种抗生素均无明显效果。病鱼主要症状是烂身、烂鳍，停止摄食，濒死鱼在水面漫游，严重者体色发黑。解剖病鱼鳃有少量出血点，肝脏严重肿大、充血，脾脏、肾脏肿大，胃肠空虚，其他组织器官无明显变化。
2.2 细菌
取所采7尾大口黑鲈的肝脏和肾脏病料，接种于普通营养琼脂培养皿上进行细菌分离培养，28 ℃下恒温培养48 h，未见细菌长出。
2.3 寄生虫
经显微镜观察，7尾大口黑鲈的鳃、血液和内脏中均未观察到大量寄生虫。
2.4 PCR扩增与序列分析
利用设计的特异性引物，对7尾大口黑鲈的组织器官病料进行PCR 检测，得到与目的条带大小相符的特异性片段(图1)。
应用DNAstar 5.0 软件对本研究中得到的测序基因序列与GenBank 中下载的弹状病毒代表株进行核苷酸序列同源性分析。本研究中引用的弹状病毒参考毒株包括杂交鳢弹状病毒(HSHV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、黄鳝弹状病毒(MARV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、狗鱼弹状病毒(PFRV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、牙鲆弹状病毒(HRV)和传染性造血器官坏死病毒(IHNV)，MSRV为本研究中患病大口黑鲈弹状病毒测序所得基因序列。同源性和遗传进化分析结果见图2。
注：M为DL2000 DNA Marker；1为阴性对照；2～8分别为第1尾～第7尾鱼
Note:M,DL2000 DNA Marker；1,negative control；2-8,PCR production of the first, second, third,fourth,fifth,sixth,and seventh individuals
图1 大口黑鲈弹状病毒的PCR检测结果
Fig.1 PCR production of rhabdovirus in largemouth bass Micropterus salmonides
2.5 组织病理变化
经过染色观察，患病大口黑鲈的肝、脾、肾等主要器官均发生了不同程度的病理变化。
脾脏的血管和脾窦内淤积大量血液；脾实质细胞呈现严重的弥漫性坏死(图3-A)，坏死细胞核固缩、崩解，有的还保持原来的细胞核或细胞轮廓，细胞大量坏死导致脾实质细胞稀疏，特别是淋巴细胞稀少。
肾脏的血管内淤积大量的血液；肾间淋巴组织细胞呈现较严重的弥散性坏死(图3-B)；多数病例肾小管上皮细胞轻度坏死，表现为其细胞核崩解，但细胞核、细胞轮廓仍完整。
肝脏的血管和肝窦内淤积大量血液；肝细胞呈程度不一的空泡变性和弥散性坏死(图3-C)，肝细胞肿大、界限不清，肝细胞索排列紊乱；少数病例肝细胞呈散在性坏死；一半病例肝脏出现少量的坏死灶，坏死灶内肝细胞崩解，周围由增生的肉芽组织包绕。
肠的肠腔无内容物，但结构正常。
图2 大口黑鲈弹状病毒的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of rhabdovirus in largemouth bass Micropterus salmonides
注：A为脾脏淤血，实质细胞弥漫性坏死；B为肾脏淤血，淋巴组织坏死，肾小管上皮坏死；C为肝脏淤血，肝细胞空泡变性和弥散性坏死
Note:A，congestion spleen, and diffuse necrosis of parenchymal cells；B，congestion kidney, lymphoid tissue necrosis, and renal tubularnecrosis;C, congestion liver, and degeneration and diffuse necrosis liver cells
图3 大口黑鲈脾、肾和肝组织的病理变化(40×)
Fig.3 Histopathological changes in liver, spleen and kidney in the diseased largemouth bass Micropterus salmoides(40×)
弹状病毒(Rhabdovirus)是一种单股不分节段的负链RNA 病毒，种类较多，在自然界中分布广泛，多数具有很强的致病性。本研究中，综合病鱼症状、流行情况、组织病理、特异性引物的PCR 扩增和测序结果，判断引起大口黑鲈鱼种烂身、大量死亡的病因，是感染了弹状病毒，弹状病毒在其他种属鱼类中已有大量报道，但在大口黑鲈属首次报道。
弹状病毒为线性负链单链RNA病毒，病毒粒子大小为(100～430)nm×(45～100)nm，形态似棒状或子弹状，通常具有5种主要结构蛋白(L、G、N、P、M)。弹状病毒科包括175种以上的成员，可感染脊椎动物、无脊椎动物和植物[1]。鱼类弹状病毒因感染宿主广、毒株种类多、毒力强，严重危害各种淡水和海水鱼。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有20多种，其中危害较大的有鲤春病毒血症病毒(SVCV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)[2-6]和杂交鳢弹状病毒(HSHV)[7]等。
弹状病毒主要感染造血组织，导致造血器官坏死[8-9]，这与大口黑鲈弹状病毒引起肝、脾、肾肿大或充血相一致。组织病理切片观察显示，患病鱼发生造血器官(主要是脾脏和肾脏)的淋巴组织弥漫性坏死，坏死的细胞核固缩、崩解，切片结果与病变症状一致，为本研究结果提供了更加有力的证据。
通过序列分析，大口黑鲈弹状病毒与杂交鳢弹状病毒和鳜鱼弹状病毒为一个分支，同源性较高。广东佛山地区也是杂交鳢和鳜鱼的主要养殖区域，因此，大口黑鲈弹状病毒很有可能是由杂交鳢或鳜鱼传染。
经过流行病学调查、实验室检测分析，确诊大口黑鲈因感染了弹状病毒，导致造血功能以及免疫功能严重下降，引发患病鱼大量死亡。本研究中报道了大口黑鲈弹状病毒，为今后大口黑鲈养殖过程中疾病的预防和控制提供了理论依据，对大口黑鲈的健康养殖具有重要意义。
参考文献：
[1] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997.
[2] Padhi A，Verghese B.Molecular evolutionary and epidemiological dynamics of a highly pathogenic fish rhabdovirus，the spring viremia of carp virus (SVCV)[J].Veterinary Microbiology，2012，156(1/2)：54-63.
[3] Mortensen H F，Heuer O E，Lorenzen N，et al.Isolation of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) from wild marine fish species in the Baltic Sea,Kattegat,Skagerrak and North Sea[J].Virus Research，1999，63(1/2)：95-106.
[4] Nichol S T，Rowe J E，Winton J R.Molecular epizootiology and evolution of the glycoprotein and non-virion protein genes of infectious hematopoietic necrosis virus，a fish rhabdovirus[J].Virus Research，1995，38(2/3)：159-173.
[5] 桂朗，李正秋，张奇亚.牙鲆一株弹状病毒病原的分离与鉴定[J].水生生物学报，2007,31(3)：345-353.
[6] Tao J J，Gui J F，Zhagn Q Y，et al.Isolation and characterization of a rhabdovirus from co-infection of two viruses in mandarin fish[J].Aquaculture，2007，262(1)： 1-9.
[7] 曾伟伟，王庆，王英英，等.一株鳢科鱼源弹状病毒的分离及鉴定[J].水产学报，2013，37(9)：1416-1424.
[8] Basurco B，Vende P，Monnier A F，et al.Genetic diversity and phylogenetic classification of viral hemorrhagic septicemia virus(VHSV)[J].Veterinary Research Communications，1995，26 (5/6)：460-463.
[9] Mulcahy D，Klaybor D，Batts W N.Isolation of infectious haematopoietic necrosis virus from a leech (Piscicola salmositica) and a copepod (Salmincola sp.)，ectoparasites of sockeye salmon Oncorhynchus nerka[J].Disease of Aquatic Organisms，1990，8：29-34.
Abstract： Diagnosis of acute mortality was investigated in cultured juvenile largemouth bass Micropterus salmonides collected in Foshan, Guangdong Province. The morbid largemouth bass swam on the water surface, had blacken and rotten skin, and fins, and was devoid of food. The postmortem examination revealed that the sick fish had hemorrhagic gills, swollen liver, spleen and kidney, reddish intestine and empting stomach. Epidemiological survey indicated that no pathogenic bacteria and parasites were found in the organs including liver, spleen and kidney, the disease being obvious infectious. The diffused necrosis was histologically observed in liver, spleen and kidney. The specific products with predicted size were obtained in the diseased fish by primers designed according to the sequence of GenBank. Comparative analysis of nucleotide sequences in the GenBank databases using Blast database network service showed that the putative gene products from the infected largemouth bass shared high homologous identity of 96.9% with hybrid snakehead rhabdovirus(HSHV)and 95.3% with Siniperca chuatsi rhabdovirus(SCRV), indicating that the mortality of largemouth bass is caused by rhabdoviruses.
Key words： Micropterus salmonides； rhabdovirus； diagnosis； pathological change
基金项目： 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室开放基金资助项目(J2013006)；浙江省科技计划项目(2012C22072,2012F20029)；浙江省自然科学基金资助项目(Y14C190013)；泰安市科技发展计划项目(201440774)
收稿日期： 2014-07-31
中图分类号：S941；S965.211
文献标志码：A
文章编号：2095-1388(2015)03-0305-04
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2015.03.013