摘要:为了将中草药作为饲料添加剂长期应用于虹鳟养殖生产，探讨了复方中草药对虹鳟Oncorhynchus mykiss抗氧化能力的影响。在水温为(17±1) ℃条件下，将体质量为(200.0±1.5) g 的1+龄虹鳟随机分为2个试验组和1个对照组，每组120尾鱼，每组设1个平行，饲养在室外循环水圆形水泥池(直径6 m)中。两个试验组鱼分别投喂添加茵陈、板蓝根等(复方一)和添加紫草、金银花等(复方二)的全价饲料，对照组鱼只投喂全价饲料，共饲养30 d。停饲24 h后，采集试验鱼的血清、肝脏、脾脏、肾脏，测定各组织中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量，以及总一氧化氮合酶(TNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性及总抗氧化能力(T-AOC)。结果表明：两个试验组虹鳟肝脏中SOD活性均上升， MDA含量均显著低于对照组(P<0.05)；复方一试验组肝、脾和肾脏中NO含量，脾脏中iNOS活性以及血清中T-AOC活性均显著高于对照组(P<0.05)，血清中GSH-PX活性也相应提高；复方二试验组肾脏中NO含量显著高于对照组(P<0.05)。研究表明，复方一较复方二能更有效地提高虹鳟的抗氧化能力。
关键词: 虹鳟；中草药；抗氧化
动物体内抗氧化能力与多种疾病的发生密切相关，是机体非特异性免疫的重要组成部分。活性氧是机体内最常见的自由基，对机体发挥正常的生理功能具有重要意义[1]。但在感染、应激或营养缺乏等异常情况下，自由基代谢平衡失调，机体产生过量的活性氧自由基，会引起机体脂质过氧化反应、蛋白质氧化损伤、DNA损伤等[2]，造成多种器官功能异常或组织病变[3]。机体抗氧化系统作为一种完整而复杂的自由基清除系统，具有清除动物体内多余活性氧、保护自身免受氧化损伤的功能[4]。该系统包括一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、维生素E等多种抗氧化剂。与人工合成的抗氧化剂相比，抗氧化系统在清除体内过量自由基和治疗疾病方面效果更佳。因此，提高抗氧化系统的机能对保持机体正常的生理状态具有十分重要的意义。
中草药为天然药物，富含增强机体免疫机能的活性物质，具有毒副作用小、资源丰富、不易产生耐药性等优点，在水产养殖中备受青睐[5]。中草药的种类丰富，针对不同的作用对象和目的具有多种配伍，为防治疾病、增强机体免疫功能提供了多种选择[6]。因此,对具有较强抗氧化性的天然中草药的研究已受到人们的重视[7]。研究表明，中草药添加剂能较好地促进施氏鲟Acipenserschrenckii[8]、哲罗鲑Hucho taimen[9]的抗氧化能力。
虹鳟Oncorhynchus mykiss是一种珍贵的世界性冷水养殖鱼类[10]。该鱼食用价值高、生长迅速、易捕捞、人工繁殖简便易行，已成为联合国粮农组织向全世界推广的产量高且品质优良的四大淡水鱼类养殖品种之一[11]。本研究中，分析了两种自组复方中草药饲料添加剂对虹鳟抗氧化能力的影响，为筛选适合的中草药配伍方剂，长期应用于虹鳟养殖生产中提供参考。
1.1 材料
试验用健康、非免疫状态下的1+龄虹鳟购自渤海冷水性鱼类试验站，体质量为(200.0±1.5)g。试验用中草药购自哈尔滨世一堂药店，烘干后备用。各试验指标测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 试验饲料的制备 试验选用2种自组复方中草药，复方一由茵陈、板蓝根等组成，复方二由紫草、金银花等组成。试验饲料中复方一中草药添加量为8.10 g/kg(饲料)，复方二中草药添加量为16.25 g/kg(饲料)。
按照各复方配比称取中草药，参照董晓慧等[12]的方法制备试验饲料，并将制备好的试验饲料于冰箱(-18 ℃)中保存备用。
1.2.2 试验设计 试验鱼先采用全价基础饲料预饲2周。试验设置2个复方中草药试验组和1个对照组，每组120尾鱼，每组设置1个平行。试验时，按照鱼体质量的2.5%确定投喂量(以投喂后当场吃完为宜)，2个试验组分别用2种添加复方中草药的基础全价饲料投喂，对照组投喂全价基础饲料，每天投喂2次。定期清理水池污物，试验于室外圆形水泥池(直径6 m)中进行，循环水养殖，水温为(17±1) ℃，连续投喂30 d。
表1 试验基础饲料配方及主要营养成分
Tab.1 Ingredients and approximate composition of the basic diet
w/%
项目item 含量content鱼粉fishmeal30.00豆粕soyabeanmeal30.00次粉sub-powder10.00饲料配方玉米蛋白粉cornproteinpowder10.00ingredient大豆分离蛋白soyproteinisolate10.00鱼油fishoil5.00磷脂phospholipid2.00预混剂premix1)3.00营养成分总能totalenergy/(kJ·g-1)18.53approximate粗蛋白质crudeprotein28.28composition粗脂肪crudefat8.93
注：1)预混剂中包括复合维生素0.3%、复合微量元素0.2%、胆碱0.2%、氧化镁0.2%、防霉剂0.02%、磷酸二氢钙1.0%
Note: Premix contains complex vitamin 0.3%, trace element 0.2%, choline 0.2%, MgO 0.2%, mildew preventive 0.02%, CaH2PO41.0%
1.2.3 样品的采集 试验结束后，从每个平行组中随机选取15尾鱼，从其尾动(静)脉采血，4 ℃下以3500 r/min离心20 min，取血清；解剖取鱼肝脏、脾脏、肾脏组织样本。将每尾鱼的血清及组织样本均于超低温冰箱(-80 ℃)中保存备用。
1.2.4 各项指标的测定
(1) 样品处理。将试验鱼各组织样本分别与生理盐水混合，充分匀浆，按不同检测指标及试剂盒要求的速度和时间离心，取上清液进行检测。血清在水浴中融化后即可检测，每个指标检测的样本数均为15。
(2) 指标的测定。按照各试剂盒说明书方法，测定一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC)，以及总一氧化氮合酶(TNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。TNOS、iNOS活力单位定义为：每毫克组织蛋白每分钟生成1 nmol NO为一个酶活力单位(U)。SOD活力单位定义为：1 mg组织匀浆液中，对SOD抑制率达50%时所对应SOD量为一个SOD活力单位(U)。GSH-PX活力单位定义为：每毫升反应液中，对GSH-PX抑制率达50%时所对应的GSH-PX量为一个GSH-PX活力单位(U)。T-AOC活力单位定义为：每分钟每毫升血清使反应体系的吸光度值每增加0.01时，为1个总抗氧化能力单位(U)。
1.3 数据处理
试验数据采用SPSS软件进行统计分析，采用最小显著差数法(LSD)进行组间显著性比较，显著性水平设为0.05。
2.1 肝脏、脾脏、肾脏中NO含量及TNOS、iNOS活性的变化
从表2可见：复方一组虹鳟肝脏、脾脏、肾脏中NO含量均显著高于对照组(P<0.05)；复方二组鱼肾脏中NO含量显著高于对照组(P<0.05)，肝脏和脾脏中NO含量与对照组无显著性差异(P>0.05)。
从表3可见：复方一、复方二对虹鳟脾脏中TNOS活性有一定的促进作用,但与对照组无显著性差异(P>0.05)；复方一组iNOS活性显著高于对照组(P<0.05)，复方二组略高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。
2.2 肝脏中SOD活性及MDA含量的变化
表2 复方中草药对虹鳟肝脏、脾脏、肾脏中NO含量的影响
Tab.2 Effect of compound Chinese herbal medicines on NO content in liver, spleen and kidney of the rainbow trout
μmol/g
组别group肝脏liver脾脏spleen肾脏kidney对照control4.95±0.54a3.01±0.19a3.43±0.34a复方一compound18.81±1.20b4.65±0.60b5.48±0.32b复方二compound25.03±0.72a3.5±0.28a4.66±0.36b
注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)；标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05),下同
Note: The means with different letters within the same column are significantly different at the 0.05 probability level; and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia
表3 复方中草药对虹鳟脾脏中TNOS和iNOS活性的影响
Tab.3 Effect of compound Chinese herbal medicines on activities of spleen TNOS and iNOS in rainbow trout
U/mg
组别group总一氧化氮合酶TNOS诱导型一氧化氮合酶iNOS对照control0.40±0.10a0.42±0.09a复方一compound10.62±0.16a0.95±0.26b复方二compound20.58±0.12a0.48±0.11a
表4 复方中草药对虹鳟肝脏中SOD活性及MDA含量的影响
Tab.4 Effects of compound Chinese herbal medicines on SOD activity and MDA content in liver of rainbow trout
组别group超氧化物歧化酶/(U·mg-1)SOD丙二醛/(nmol·mg-1)MDA对照control14.41±1.53a3.53±0.78b复方一compound117.76±1.38a3.22±0.71ab复方二compound214.83±1.26a1.58±0.27a
从表4可见：2种复方中草药对虹鳟肝脏中SOD活性具有一定的促进作用，但与对照组无显著性差异(P>0.05)；复方二组MDA含量显著低于对照组(P>0.05)，复方一组略低于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。
2.3 血清中T-AOC和GSH-PX活性的变化
从表5可见：复方一组鱼血清中的T-AOC活性显著高于对照组(P<0.05)，复方二组略高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)；2种复方中草药对试验鱼血清中GSH-PX活性具有一定的促进作用，但与对照组无显著性差异(P>0.05)。
表5 复方中草药对虹鳟血清中T-AOC和GSH-PX活性的影响
Tab.5 Effect of compound Chinese herbal medicines on activities of serum T-AOC and GSH-PX in rainbow trout
U/mL
组别group总抗氧化能力T-AOC谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX对照control0.26±0.022a133.28±9.38a复方一compound10.35±0.038b169.34±12.79a复方二compound20.33±0.022a135.98±11.08a
3.1 中草药对虹鳟NO含量及TNOS活性的影响
NO作为免疫调节剂、神经递质和血管扩张剂，广泛分布于动物体各组织中。NO可与机体组织中超氧化物阴离子形成不活跃的亚硝酸盐，发挥超氧化物细胞毒效应的化学屏障作用，因此，也被称为超氧化物清除剂[13]。NO可直接与导致膜脂过氧化反应和细胞死亡的脂质烷氧基、过氧化氢自由基反应，终止脂质自由基传播链反应，最终达到抗氧化目的[14]。NO与铁可生成亚硝酰铁，阻止金属催化的活性氧的形成，抑制叔丁基过氧化氢生成烷氧基和过氧化氢自由基[13]。机体中TNOS包括eNOS、nNOS、iNOS三种类型。正常生理状态下，eNOS、nNOS表达水平较低，仅维持机体正常生理功能，但在炎症状态下，iNOS被激活产生大量NO，导致组织损伤[15]。许多中草药对NO的生成具有调节作用。本试验中，复方一组虹鳟肝脏、脾脏、肾脏中NO含量显著高于对照组；复方二组鱼肾脏中NO含量显著高于对照组，肝脏和脾脏中NO含量与对照组无显著性差异；2种复方对虹鳟脾脏TNOS活性有一定促进作用。这表明2种复方在虹鳟机体内起到了抗氧化作用，促进了体内氧自由基的清除。但NO针对细胞氧化损伤具有两相性，低浓度的NO可以保护组织细胞免受损伤，随着浓度的增加，NO将会从抗氧化剂转变成氧化剂。因此，合理使用中草药是保证机体健康的重要因素。
3.2 中草药对虹鳟SOD活性及MDA含量的影响
超氧阴离子自由基
·)是机体内正常的代谢产物，低浓度
·是维持生命活动所必需的，但当·浓度过高时，则会引起核酸链断裂，造成机体不饱和脂肪酸过氧化损伤，并损害机体生物大分子[16]。SOD为一类广泛存在于生物体内的金属酶，是机体内重要的自由基清除剂，可以催化·歧化为过氧化氢和氧，平衡机体的氧自由基，避免发生不良反应，在抗氧化、延缓机体衰老、改善机体免疫力方面具有广泛应用[17]。本试验中，2种复方中草药均能提高虹鳟肝脏中SOD活性，尤其复方一。这表明2种复方中草药提高了虹鳟体内抗氧化能力，有助于提高机体防御外界刺激的能力。但数据差异性并不显著，原因可能是试验鱼个体差异，或本试验中的中草药作用力较温和，药效较持久，更偏向于机体的全面调理，异于其他刺激性促进剂，无法使SOD活性显著升高。
MDA作为氧自由基攻击多不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物[18]，可间接反映机体内活性氧自由基水平和脂质过氧化程度，间接反映出机体受损伤的情况[19]。肝脏中，复方二组鱼的MDA含量显著低于对照组，复方一组略低于对照组。这表明本试验用2种复方中草药均能降低MDA含量，不同程度地削弱了产生自由基的能力，降低了组织损伤程度，对机体存在积极影响。试验组间存在差异性的原因可能是同一类药性药物的化学成分不同，且机体机能状态可以影响药物作用，从而造成机体对药物的吸收、分布和代谢出现差异，最终导致药物的生物效应不同[20]。
3.3 中草药对虹鳟T-AOC和GSH-PX活性的影响
T-AOC是机体抗氧化和清除自由基能力的总和，是衡量抗氧化系统功能状况的综合性指标[21]，可代表和反映机体对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态[22]，对机体体液、细胞、组织酶系统和非酶系统抗氧化能力综合评判具有重要的意义。本试验中，虹鳟饲料中添加2种复方中草药后，复方一组鱼血清中T-AOC活性显著高于对照组，复方二组略高于对照组，这表明复方一提高机体抗氧化的能力更强。石宏武等[23]研究发现，投喂中草药饲料后，金鱼组织中T-AOC活性先短暂升高，随着试验的进行，组织中毒性产物的量超过了机体的清除能力，抗氧化保护机制受损，造成组织损伤。说明在试验过程中，鱼机体可能受到中草药毒性成分损伤。本试验中仅添加了一种浓度的复方中草药，也未观察鳃、血液、肝脏等组织器官是否出现损伤变化，因此，这2种复方中草药的最佳添加浓度及毒性损伤需进一步研究。
GSH-PX具有清除机体内脂质过氧化物、消除活性氧自由基对组织损伤的功能，是一种常见的活性氧自由基清除剂[24]。本试验中，复方一促进了试验鱼血清中GSH-PX的活性，与SOD、T-AOC等的变化规律一致，这表明复方一作为饲料添加剂可以提高虹鳟抗氧化能力。
综上所述，本试验中选取的2种复方中草药抗氧化剂中，复方一在降低肝脏中MDA含量，提高肝脏中SOD、血清中T-AOC和GSH-PX的活性和肝脏等组织中NO含量等的效果更为明显，能明显增强虹鳟机体的抗氧化能力，推测其作为一种饲料添加剂在水产养殖生产中具有良好的应用前景。
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Abstract： A feeding trial was conducted to evaluate the effects of two kinds of Chinese herbal compound on antioxidant defenses of rainbow trout Oncorhynchus mykiss for application of Chinese herbal compound in rainbow trout culture. Juvenile rainbow trout of 1+ old with body weight of (200.0±1.5)g were randomly divided into outdoor circulating circular tanks at a rate of 120 fish per tank and fed basal diet and the diets containing two kinds of Chinese herbal medicine compounds (No.1 Artemmisia capillaries and Isatis indigotica; No.2 Arnebia guttata and Lonicera japonic)at feeding rate of 2.5% with duplication at water temperature of (17±1) ℃ for 30 days. The NO and malonaldehyde (MDA) contents, activities of total nitric oxide synthase (TNOS), inducible nitric oxide synthase (iNOS), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-PX) and total antioxidant capacity (T-AOC) were determined in serum, liver, spleen and kidney of the rainbow trout fasted for 24 hours at the end of the experiment. The results showed that there were significantly higher activity of SOD and significantly lower content of MDA in liver in the rainbow trout fed the diets containing Chinese herbal medicines than those in the juveniles fed the basal diet (P<0.05). The contents of NO in liver, spleen and kidney, the activity of iNOS in spleen, and the serum T-AOC were found to be increased significantly in the rainbow trout fed the diets containing Chinese herbal compound 1 (P<0.05), with higher activity of GSH-PX in serum. The rainbow trout fed the diets containing Chinese herbal compound 2 had significantly higher content of NO in the kidney. The findings indicate that compound 1 improves the antioxidant capacity effectively, and can be used as an excellent antioxidant of Chinese herbal medicine for rainbow trout.
Key words： Oncorhynchus mykiss; Chinese herbal medicine; antioxidant capacity
基金项目： 国家“十二五”科技支撑计划项目(2012BAD25B10)
收稿日期： 2014-06-13
中图分类号：S942.5
文献标志码：A
文章编号：2095-1388(2015)02-0170-05
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.011