<span class="emphasis_bold">多棘海盘车化学成分的分离与鉴定</span>

(1.大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023；2.大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁大连116023)

摘要：采用硅胶柱色谱、薄层制备色谱、凝胶柱色谱等手段分离纯化，通过理化常数测定、光谱数据分析和文献对照等方法,对多棘海盘车AsteriasamurensisLutken未被发现的化学成分进行结构鉴定。结果从多棘海盘车中分离得到4种化合物,化合物的结构分别为Phalluside 1( 化合物1)；N-(胆甾-5-烯-3β-烃基)-3β-醋酸酯-5-乙基-17β-咪唑羧酰胺(化合物2)；胆甾-5，20(22)-二烯-3β-醇(化合物3)；(2S)-1-O-7溴烷醇甘油(化合物4)。研究表明，化合物1、2、3、4为首次从海盘车属中分离得到的化合物。

多棘海盘车AsteriasamurensisLutken隶属于海盘车科Asteriidae、海盘车属Asterias，是一种海洋无脊椎动物。海星中含有多糖、脂类、甾醇、皂苷、生物碱等多种化学成分和活性物质，具有广泛的药理作用和生物活性。海洋活性物质因支链丰富多样、骨架结构新奇、生理活性独特而备受关注[1]。国内外学者已从海星中分离纯化出了多种具有生物活性的化学成分，但仍然有许多具有潜在价值的化合物尚未分离得到。为了更加全面分析多棘海盘车所含有的化合物，本研究中从多棘海盘车70%乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分中，利用多种色谱技术相结合的手段，首次从多棘海盘车中分离得到4种化合物，并对其结构进行了鉴定，旨在为多棘海盘车的开发利用提供参考。

1材料与方法

试验用多棘海盘车采自辽宁省大连市黑石礁海域。

试验药品主要有硅胶(200～300目)(Sigma公司)、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(Sigma公司)、ODS反相硅胶(200～300目)(购于北京吉瑞森科技有限责任公司)。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均为国产分析纯。

试验仪器主要有RE-52CS型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、ZF-90型暗箱式紫外透射仪(上海顾村电光仪器厂)、XT5型显微熔点测定仪(熔点未校正，北京科仪电光仪器厂)、BRUKER-APX-300型1H核磁共振仪(瑞士BRUKER公司)、BRUKER-APX-150型13C核磁共振仪(瑞士BRUKER公司)。

1.2.1 多棘海盘车化合物的分离取20 kg多棘海盘车剪碎，用体积分数为70%的乙醇回流提取2次，每次2 h，过滤，合并提取液，用旋转蒸发器减压浓缩得到水溶液，置于冰箱(-20 ℃)中保存备用。

依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对提取得到的水溶液进行多次萃取，直至有机层基本无色，浓缩，分别得到石油醚部分(65 g)、乙酸乙酯部分(130 g)和正丁醇部分(150 g)。

将正丁醇部分进行硅胶柱色谱分离，以乙酸乙酯与甲醇的混合液(二者的比为100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)进行梯度洗脱得到6个组分。其中组分2重结晶得到化合物1(68 mg)；组分3进行硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷与甲醇的混合液(二者的比为100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)进行梯度洗脱得到的亚组分c反复运用凝胶柱进行分离，得到化合物2(18 mg);组分4进行硅胶柱色谱分离，以乙酸乙酯与甲醇的混合液(二者的比为100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)进行梯度洗脱得到的亚组分b反复运用凝胶柱分离，得到化合物3(40 mg)。将乙酸乙酯部分反复运用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷与甲醇的混合液(二者的比为100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)进行梯度洗脱，结合Sephadex LH-20分离，最终得到化合物4(18 mg)。

1.2.2 化合物结构的鉴定1H NMR谱在BRUKER-APX-300型1H核磁共振仪上进行，13C NMR谱在BRUKER-APX-150型13C核磁共振仪上进行。样品均溶于D2O，样品浓度为20 mg/mL。

2结果

对多棘海盘车70%乙醇提取物，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到4种化合物，分别为化合物1、2、3、4。

化合物1 为白色粉末状固体，mp 216～220 ℃，易溶于甲醇，微溶于氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂,分子式为C41H75NO9。1H NMR谱显示，δH8.52处有酰胺N-H特征信号，δC106.0为糖苷异头碳信号。神经酰胺与鞘胺醇都具有N-酰基神经鞘胺醇的骨架结构，骨架中两个羟基的位置是固定的，同时已经确定羟甲基与糖成苷相连接[2]。结合δH3.85～4.87分子中含有多个连氧碳上的质子，推测此化合物为鞘脂糖苷类化合物。其1D NMR谱数据如下：1H NMR(500 MHz，MeOH)，δH8.52(d，J=8.6 Hz，1H，NH)，7.65(br s，1H，OH)，7.25(br s，1H，OH)，7.17(br s，1H，OH)，6.90(br s，1H，OH)，6.41(br s，1H，OH)，6.20(d，J=15.6 Hz，1H，H-10)，6.00(dd，J=15.4，6.0 Hz，1H，H-4)，5.90(dt，J=15.4，6.2 Hz，1H，H-5)，5.72(m，1H，H-11)，5.48(m，1H，H-8)，5.34(d，J=4 Hz，1H，H-1″)，4.80(m，1H，H-2)，4.75(m，1H，H-3)，4.71(dd，J=10.3，5.9 Hz，1H，H-1)，4.57(m，1H，H-2′)，4.50(br d，J=10.3 Hz，1H，H-6″)，4.36(m，1H，H-6″)，4.23(m，1H，H-1)，4.21(m，2H，H-3″，H-4″)，4.03(m，1H，H-2″)，3.90(m，1H，H-5″)，2.21(m，2H，H-7)，2.16(m，3H，H-3′，H-6)，2.12(m，2H，H-12)，2.00(m，1H，H-3′)，1.76(s，3H，H-19)，1.75(m，2H，H-4′)，1.36(m，4H，H-5′，H-13)，1.29(br s，28H)，0.90(t，J=6.7 Hz，6H，H-18，H-16′)。其13C NMR(125 MHz，MeOH)谱数据如下：δ 177.2(s，C-1′)，134.8(d，C-10)，133.4(s，C-9)，132.3(d，C-4)，132.0(d，C-5)，130.9(d，C-8)，128.5(d，C-11)，104.7(d，C-1″)，78.0(d，C-5″)，77.9(d，C-3″)，75.0(d，C-2″)，73.1(d，C-2′)，72.9(d，C-3)，71.6(d，C-4″)，70.0(t，C-1)，62.7(t，C-6″)，54.6(d，C-2)，35.9(t，C-3′)，33.5(t，C-12)，33.1(t，C-6)，33.1(t)，33.0(t)，30.9(2xt)，30.9(2xt)，30.8(2xt)，28.2(t，C-7)，26.2(t，C-4′)，23.8(2xt)，14.5(2xq，C-18，C-16′)，12.8(q，C-19)。查阅相关文献发现，此化合物的波谱数据与文献报道的Phalluside 1基本一致，故确定化合物1为Phalluside 1，结构为1-O-(β-D-葡萄糖基)-(4E,8E,10E)-2-(2′R-2-羟基十八烷基酰胺基)-4,8,10-三烯-1,3-二醇[1-O-(β-D-glucose)-(4E,8E,10E)-2-(2R′-2-hydroxy octadecyl)-4,8,10,-amide-1,3-diol][3]。

化合物2 为白色晶体，mp 279～282 ℃，易溶于氯仿，微溶于甲醇，不溶于水，分子式为C47H75NO2。Liebermann-Burchard 反应呈阳性，提示可能为甾体类化合物。其1D NMR谱数据如下：1H NMR(500 MHz，CDCl3)，δH5.36(m，2H，H-6，H-6′)，5.10(d，J=8.2，1 H，NH)， 3.73(m，1 H，H-3)，3.52(m，1 H，H-3′)，1.01(s，3 H，H-19)，0.99(s，3 H，H-19′)，0.91(d，J=6.5，3H，H-21)，0.87(d，J=6.6，3H，H-26)， 0.86(d，J=6.6，3H，H-27)，0.70(s，3 H，H-18′)，0.67(s，3H，H-18)。其13C NMR(125 MHz，C5D5N)谱数据如表1所示。查阅相关文献发现，化合物2的结构为N-(胆甾-5-烯-3β-烃基)-3β-醋酸酯-5-乙基-17β-咪唑羧酰胺[N-(Cholest-5-en-3β-yl)-3β-hydroxyandrost-5-ene-17β-carboxamide][4]。

化合物3 为白色无定形粉末，mp 145～148 ℃，易溶于吡啶，微溶于甲醇、氯仿，不溶于水，分子式为C27H44O。Liebermann-Burchard 反应呈阳性，提示可能为甾体类化合物。其1H-NMR(500 MHz，C5D5N) 波谱中：5个甲基质子信号为1.86(3H，s，18-Me)，2.06(3H，d，19-Me)，2.07(3H，d，J=6.5 Hz，26-Me)，2.15(3H，d，J=6.5 Hz，27-Me)，2.24(3H，d，J=6.5 Hz，21-Me)，2个烯氢质子信号为6.14(1H，s，H-6)和6.61(1H，s，H-22)，1个连氧碳的氢信号为5.04(1H，s，H-3)。13C NMR低场可观察到4个烯碳信号，其中δC140.1、121.7提示为△5(6)双键。其13C NMR(125 MHz，C5D5N)波谱数据如表2所示，从NMR谱图数据中可看出，比胆固醇多了一个碳碳双键。查阅相关文献发现，化合物3的结构为胆甾-5，20(22)-二烯-3β-醇[Cholest-5,20(22)-diene-3β-ol][5]。

化合物4 为白色粉末，mp 64～65 ℃，易溶于氯仿，微溶于甲醇，不溶于水。分子式为C30H60O4。1H NMR显示，高场没有次甲基信号，其中在δH0.87(t，6.4)的末端甲基信号及其相邻的δH1.27处含有46个质子积分面积的叠加峰，暗示该化合物为链状脂肪酸结构。结合其在δH2.34(t，7.5)和δH1.61(m)分别出现的两个质子信号，说明该化合物为一直链脂肪酸。进一步根据13C NMR的1个羰基碳δC174.53、3个连羟基碳δC63.49～70.40、1个甲基碳δC14.25和分布在δC34.29～22.82之间的25个亚甲基碳信号，推测其结构为三十烷酸甘油酯。其1D NMR谱数据如下：1H NMR(500 MHz，CDCl3)，δ 0.87(t，J=6.4 Hz，3H，Me-27′)，1.05-1.27(br s，46H，H-4′ to H-26′)，1.61(m，2H，H-3′)，2.34(t，J=7.5 Hz，2H，H-2′)，3.60(dd，J=11.6，5.8 Hz，1H，H-3a)，3.68(dd,J=11.6,3.8 Hz，1H，H-3b)，3.92(m，1H，H-2)，4.14(m，2H，H-1)。其13C NMR(125 MHz，CDCl3)谱数据如下:δ 65.26(C-1)，70.40(d，C-2)，63.49(t，C-3)，174.53(s，C-1′)，34.29(t，C-2′)，25.04(t，C-3′)，29.27-29.83(t，C-4′ to C-24′)，32.05(t，C-26′)，22.82(t，C-25′)，14.25(q，C-27′)。查阅相关文献发现，化合物4的结构为(2S)-1-O-7溴烷醇甘油[(2S)-1-O-7 heptatriacontanoyl glycerol][6]。

3讨论

提取方法不同对提取的化学成分种类有着明显的影响。李岩等[7]利用酶解、50 ℃水浸提的方法从海星中分离纯化出6种化合物：胆甾-5-烯-3-醇；丙二酸；乙酸钠；正壬烷；麦角甾-7,9,22-三烯-3-醇；一水合立方癸烷。其中前5种为首次从海星纲中分离得到，一水合立方癸烷为新化合物。程平等[8]利用95%乙醇浸提、正丁醇萃取、大孔树脂层析和ODS、Sephadex LH-20层析分离，从多棘海盘车中分离出6种化合物：Amurensoside D；色氨酸；3β-O-硫酸酯化-6α,23β-二羟基-胆甾-9(11)-23-羰基-硫酸盐；3β-O-硫酸酯化-6α-羟基-胆甾-9(11)；20(22)-二双键-23-羰基-硫酸盐；3β-O-硫酸酯化-6α-羟基-麦角甾-9(11)-双键-23-羰基-硫酸盐。其中色氨酸为首次从多棘海盘车中分离得到。

本研究中从多棘海盘车70%醇提物中得到4种化合物：Phalluside 1；N-(胆甾-5-烯-3β-烃基)-3β-醋酸酯-5-乙基-17β-咪唑羧酰胺；胆甾-5，20(22)-二烯-3β-醇；(2S)-1-O-heptatriacontanoyl glycerol。这4种化合物均为首次从海盘车属中分离得到，其余组分中的化学成分有待进一步分离纯化，其生物活性有待进一步研究。

近年来，海洋天然产物的开发应用已经成为研究的热点，海洋无脊椎动物已经被证实是众多药源化合物的主要来源。海星资源丰富，在中国渤海、黄海海域均有广泛分布，其含有的活性成分具有抗癌、抗病毒、降血压和抗氧化等多种生理功能，在人类肿瘤治疗及心血管疾病等方面发挥了不可替代的作用，应用前景十分广阔。目前，尚未对多棘海盘车进行有效利用，原因是对其所具有的成分没有完全认识。本研究中发现的4个化合物分别属于鞘脂糖苷类化合物(化合物1)、甾体类化合物(化合物2、3)和脂肪酸类化合物(化合物4)。这些发现将为多棘海盘车的开发利用提供重要的基础数据。

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SeparationandidentificationofchemicalconstituentsfromstarfishAsteriasamurensisLutken

(1.College of Food Science and Engineering， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China； 2.College of Marine Science and Environment， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China)

Abstract：The unindentified chemical constituents were isolated and analyzed by column chromatography on silica gel, TLC, sephadex LH-20, and spectral analysis, especially by NMR techniques in the starfishAsteriasamurensisLutken. Four compounds were obtained and their structures were elucidated: Phallusid1(compound 1), N-(Cholest-5-en-3β-yl)-3β-hydroxyandrost-5-ene-17β- carboxamide (compound 2), Cholest-5,20 (22)-diene-3β-ol (compound 3), and (2S)-1-O-hepta-triacontanoyl glycerol (compound 4). The compounds 1, 2, 3, and 4 were isolated from the genusAsteriasfor the first time.

Key words：AsteriasamurensisLutken； chemical constituent； separation and purification； structure identification

作者简介：田丽冉(1986—)，女，硕士研究生。E-mail:296943522@qq.com

通信作者：谭成玉(1973—)，女，副教授。E-mail：tanchyu@dlou.edu.cn；李伟(1964—)，男，教授。E-mail:aisingioro@hotmail.com