注：A为石油醚层；B为乙酸乙酯层；C为正丁醇层；D为乙醇粗提物
Note:A,petroleum extract;B, ethyl acetate extract; C, n-butyl alcohol extracts; D,ethanol crude extract
图1 海星甾体化合物粗品薄层层析图
Fig.1 The thin-layer chromatogram(TLC) of steroids in crude extracts from starfish
摘要：用体积分数为70%的乙醇对多棘海星Asteriasamurensis进行热浸提，减压浓缩后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别浓缩乙酸乙酯层和正丁醇层，得到海星总甾体化合物，对总甾体化合物的含量和抑制血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)的活性进行了测定，并将海星总甾体化合物通过正向硅胶柱色谱和SephadexTMLH-20柱色谱进一步分离纯化，根据薄层色谱分析收集有效成分。结果表明：正丁醇层中总甾体化合物的含量最高，石油醚层中的含量最低；海星乙醇粗提物、乙酸乙酯层和正丁醇层中的总甾体化合物对ACE酶活性有明显的抑制作用，而石油醚粗提物的抑制作用则较低，其中浓度为100 mg/mL的正丁醇层溶液对ACE酶的抑制率最高(78.05%)，其IC50值最低，为27.76 mg/mL；正丁醇层中的总甾体化合物通过正向硅胶和Sephadex LH-20柱色谱得到F1～F88个亚组分，其中F3在薄层色谱(TLC)中为单点，醋酸酐-浓硫酸反应(Liebermann-Burchard反应)为阳性，提示为甾体类化合物。
关键词：海星；甾体化合物；血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)
甾体化合物具有软化血管、活血、强心、抗炎、镇静、促进生长发育等生理活性，并在生殖活动过程中起着重要的作用[1-3]。海星中甾体化合物含量丰富，基本上每种海星都含有甾体类化合物[4]。从海星中得到的甾体化合物，大部分具有3β、6α(或6β)、8β、15α(或15β)、16β-多羟基胆甾烷母核的结构，有时在4β、5α、7α(或7β)，偶尔在14α位置具有一个或多个羟基，且一般支链具有25(S)羟基[5-6]。海洋甾体化合物因支链丰富多样、骨架结构新奇、生理活性独特而备受关注[7]。但目前尚未见对海星中具有抑制血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)活性的化学成分的研究，本研究中，以抑制ACE活性为筛选模型，对海星总甾体化合物进行提取、分离纯化，旨在为海星甾体类物质降血压药物的开发提供理论和试验依据。
1.1材料
试验用多棘海星Asteriasamurensis采自大连市黑石礁海域。
试验试剂主要有：硅胶(200～300目)、薄层层析板(自制)、血管紧张素Ⅰ转化酶(Sigma公司)、马尿酸(Sigma公司)、Hip-His-Leu(Sigma公司)、齐墩果酸标准品(天津飞鹰制药有限公司)，香草醛、浓硫酸、甲醇(色谱醇，Sigma公司)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、Na2B4O7、H3BO7、CF3COOH等均为分析纯。
试验仪器主要有：高效液相色谱仪(南京科捷分析仪器有限公司)，色谱柱(SinoChrom ODS-BP E1722557，大连依利特公司)，UV1750紫外分光光度计(岛津仪器有限公司)，冷冻干燥机(北京博医康试验仪器有限公司)，RE-52CS型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，SY2-4型电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂)，PHS-25C 型数显酸度计(上海创发电子科技有限公司)。
1.2方法
1.2.1 海星总甾体化合物的提取 取20 kg海星剪碎，于体积分数为70%的乙醇中热浸提2次，每次2 h，过滤，取上清液，用旋转蒸发器减压浓缩得到水溶液，即海星乙醇粗提物，于冰箱(-20℃)中保存备用。
依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对提取到的水溶液进行多次萃取，直至有机层基本无色，浓缩，分别得到石油醚萃取部分(65 g)、乙酸乙酯萃取部分(130 g)和正丁醇萃取部分(150 g)。
1.2.2 海星总甾体化合物的分离 将正丁醇部分(150 g)进行硅胶柱色谱，以乙酸乙酯与甲醇的混合液(体积比分别为100∶0～9、10～1∶1)进行梯度洗脱，每个比例洗脱5～8个柱体积，分别收集洗脱液，浓缩，通过薄层色谱分析合并流分，得到F1～F88个亚组分。
1.2.3 海星总甾体化合物的鉴定 利用醋酸酐-浓硫酸反应(Liebermann-Burchard，L-B反应)检测所得到的物质是否为甾体化合物。将样品溶于冰醋酸中，加入醋酸酐与浓硫酸混合液(体积比为20∶1)，观察颜色的变化。
1.2.4 海星总甾体化合物含量的测定 甾体化合物可与香草醛-硫酸溶液发生反应，呈灰绿色，于540 nm处有最大吸收峰，故常用此方法测定甾体化合物的含量[8]。
分别取浓度为400 μg/mL的齐墩果酸标准品溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，注入具塞试管中，各加入体积分数为95%的乙醇0.45、0.40、0.30、0.20、0.10、0 mL，补足至0.50 mL， 再分别加入0.50 mL 8%的香草醛试剂，摇匀，置于水浴中缓慢加入5 mL 72%的硫酸，摇匀，立即放入62 ℃恒温水浴中保温20 min，迅速取出置于水浴中冷却10 min，在540 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
分别取适量的海星乙醇粗提物以及石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层中的总甾体化合物，配成一定浓度的溶液，用香草醛-硫酸反应进行测定，操作方法同标准曲线的绘制。各溶剂中总甾体化合物的含量根据标准曲线求出。
1.2.5 ACE活性的测定 参考朱晓杰等[9]、Nakamura等[10]的方法进行。用ACE水解底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，简称HHL)C末端的二肽His-Leu，生成马尿酸。使用高效液相色谱(HPLC)测定马尿酸生成量，计算ACE抑制率，从而推测是否具有降血压活性。
将海星乙醇粗提物、石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层样品(以溶剂为溶质)分别配成浓度为100、50、25、12.5 mg/mL的水溶液，以蒸馏水作为对照。用硼酸缓冲溶液将ACE配成 60 U/L的酶溶液。取海星甾体化合物样品10 μL放入0.5 mL的离心管中，加入ACE 30 μL，37 ℃条件下反应5 min后，加入50 μL底物溶液，37 ℃条件下继续反应30 min后，加入10 μL 10%的三氟乙酸终止反应，得到反应液[11]。用HPLC测定反应液中马尿酸的生成量，A液： 用1000 mL体积分数为30%的甲醇(含有1 mL三氟乙酸及0.5 mL冰乙酸)，B液：用1000 mL 体积分数为70%的甲醇(含有1 mL三氟乙酸及0.5 mL冰乙酸)，调A、B液的pH为3.0～3.3，然后进行梯度洗脱，最后在波长为228 nm下进行测定[11]。
2.1海星总甾体化合物的提取、分离
本试验中用70%的乙醇对海星进行热浸提后，减压浓缩，用等体积的石油醚萃取脱脂，再依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，获得含大量甾体化合物的部分，剩余的水层部分主要为蛋白质、糖等大分子物质。利用展开剂[φ(氯仿)∶φ(甲醇)∶φ(水)=7∶3∶1]进行薄层层析，结果表明，不同溶剂提取物中均含甾体化合物，但乙酸乙酯和正丁醇溶剂中呈现的斑点较多(图1)。
注：A为石油醚层；B为乙酸乙酯层；C为正丁醇层；D为乙醇粗提物
Note:A,petroleum extract;B, ethyl acetate extract; C, n-butyl alcohol extracts; D,ethanol crude extract
图1 海星甾体化合物粗品薄层层析图
Fig.1 The thin-layer chromatogram(TLC) of steroids in crude extracts from starfish
近年来，已有学者进行了对海星中甾体化合物的分离研究，Ikegami 等[12]从多棘海盘车中分离得到新甾体化合物6a-羟基-3β-磺酸-氧化-5a-孕烷-9(11)-双键-20-羰基，Liu等[13]从正丁醇部分分离得到了6个甾体硫酸盐；Levina等[14]从远东海星Henriciasanguinolenta和H.leviusculaleviuscula中分离得到1个新的三羟基甾酮化合物。本试验中，由于乙酸乙酯层和正丁醇层含有未萃取完全的脂溶性物质，故采用正向硅胶柱色谱进行进一步分离。将正丁醇层经过正向硅胶柱色谱后，按照其极性的大小，得到18个溶剂。将其中的F组分再次经过正向硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱色谱，得到F1～F88个亚组分，利用展开剂[φ(氯仿)∶φ(甲醇) =9∶1]对甾体化合物F3进行薄层色谱分析，结果显色后为单点(图2)。
图2 甾体化合物F3的TLC检测结果
Fig.2 TLC of F3steroid
2.2海星中甾体化合物的鉴定
海星甾体化合物F3溶液出现了黄—红—紫—绿的颜色变化，L-B反应为阳性，说明该化合物为甾体化合物。
2.3海星各溶剂中甾体化合物的含量
以齐墩果酸标准品的吸光度(Y)为纵坐标，以标准品浓度(X)为横坐标，制得标准曲线，回归方程为Y=0.0024X-0.0225，相关系数R2=0.9994。根据标准曲线算出各溶剂中总甾体化合物的含量，其中，正丁醇层中总甾体化合物的含量最高，石油醚层中最低，仅为0.54 mg/g(图3)。
图3 海星各溶剂中总甾体化合物的含量
Fig.3 The contents of steroids in all extracts from starfish
2.4海星提取物对ACE酶活性的抑制作用
海星提取物对ACE酶的抑制作用随着样品浓度的降低而降低。如图4所示，海星乙醇粗提物、乙酸乙酯层和正丁醇层总甾体化合物对ACE酶活性均具有明显的抑制作用，而石油醚粗提物的抑制作用则较低；浓度为100 mg/mL的正丁醇层溶液对ACE酶的抑制率最高，为78.05%。
图4 海星各溶剂中总甾体化合物对ACE活性的抑制率
Fig.4 The inhibitory activity of starfish extracts for ACE
半数抑制浓度(IC50)是指ACE抑制率达到50%时的样品浓度。通过SPSS 17.0软件分析可知：海星各溶剂中，石油醚层的IC50值最大，为182.71 mg/mL,说明石油醚层对ACE的抑制效果不显著；正丁醇层的IC50值最小，仅为27.76 mg/mL;乙醇粗提物IC50值为39.84 mg/mL,乙酸乙酯层IC50值为36.27 mg/mL。
本试验中，为筛选具有抑制ACE活性的甾体化合物，通过正向硅胶柱层析、SephadexTMLH-20柱层析和薄层层析对海星中甾体化合物进行提取、分离纯化。各溶剂中甾体化合物含量的测定结果和ACE活性试验结果表明，石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层甾体化合物的含量依次增大，而各溶剂对ACE酶的抑制率也依次增大，因此可推断，甾体化合物的含量可以影响ACE酶的活性。
近年来，由高血压、高血脂引起的心脑血管疾病逐渐增多，高血压、高血脂现已成为人类健康的一大杀手[15-16]。ACE酶既可以分解有缓解血管紧张作用的舒缓激肽，又可以产生血管紧张素，从而使血压上升，是高血压蛋白酶-血管紧缩素(RAS)系统最重要的调节因子。 ACE抑制剂(ACEI)具有使血管扩张、降低血压的作用，从而改善糖代谢紊乱，是人们普遍使用的降血压药物，在治疗高血压的过程中发挥着一定的作用。从天然产物中得到的ACEI，作用温和、毒性小，可多途径、多靶点作用，因此，从海星中分离安全有效的降血压成分具有重要的意义。
海洋生物为适应海洋环境而产生的生物活性物质是陆地生物所不能及的。海星甾体化合物有降血压作用，它直接作用于血管系统，不受迷走神经分布的影响，非组织胺释放的结果或对独立的α与β受体的作用，且与触角的传导和胆碱能作用无关。因此，海星甾体化合物可以作为降血压药物的有效成分，为新药和保健品的研制提供参考。
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Abstract：The total steroids were extracted from starfishAsteriasamurensisby 70% ethanol, and then by petroleum ether, ethyl acetate and n-butyl alcohol, and the ethyl acetate andn-butyl alcohol extracts were evaporated. The inhibitory activity of angiotensin Ⅰ-coverting enzyme(ACE) in total steroids was determined and purified by different chromatographic methods including silica gel column and SephadexTMLH-20 for screening of bioactive constituents from the starfish. The determination showed that there was the maximal steroids in the n-butyl alcohol extracts and the minimal steroids in petroleum ether extracts. The ethanol extracts, ethyl acetate and n-butyl alcohol extracts were shown to contain inhibitory activity of ACE, the maximal ACE inhibition rate (78.05% at 100 mg/mL) and minimal IC50(27.76 mg/mL) in the n-butyl alcohol fraction, and lower ACE inhibition in the petroleum fraction. Eight subunits from F1to F8were obtained by silica gel column and Sephadex LH-20, in which only F3with positive L-B reaction showed single spot by thin-layer chromatogram(TLC).
Key words：Asteriasamurensis； steroid； angiotensin I-converting enzyme(ACE)
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.04.016
文章编号：2095-1388(2014)04-0409-04
收稿日期：2013-11-08
基金项目：国家海洋局公益性行业科研专项(201205022-7)；大连市科学技术基金资助项目(2011J21DW012)
中图分类号：R914
文献标志码：：A