<span class="emphasis_bold">底物诱导海洋假单胞菌DEH138A产生脱卤酶的研究</span>

(1.中国科学院大连化学物理研究所海洋生物产品工程组, 辽宁大连 116023; 2.中国科学院大学, 北京100049)

摘要：海洋假单胞菌PseudomonasstutzeriDEH138A可以产生两种诱导型脱卤酶, 即L-卤代酸脱卤酶(L-DEX)和D-卤代酸脱卤酶(D-DEX)。用DL-2-氯丙酸(DL-2-CPA)、D-2-氯丙酸(D-2-CPA)和L-2-氯丙酸(L-2-CPA)3种诱导物分别作为种子培养与发酵培养碳源，诱导菌株DEH138A，通过HPLC检测反应体系中氯丙酸的剩余量来评估酶活性,研究底物对其酶活性的影响，并优化培养方式, 实现单一构型卤代酸脱卤酶的定向诱导。结果表明：L-2-CPA可定向诱导L-DEX的产生,L-2-CPA作为唯一碳源诱导时得到的L-DEX酶活性是D-DEX酶活性的85倍,优化培养获得的L-DEX和D-DEX最高酶活性分别为6.11×10-2、3.23×10-3U/mL(培养基),与DL-2-CPA作为诱导底物时相比较，分别提高了5.1倍和2.3倍。研究表明，L-2-CPA具有诱导专一性,实现了L-DEX的定向诱导, 但对于D-DEX, 则不能用L-DEX被相应构型底物诱导产生的机理解释, 有待进一步研究。

脱卤酶是催化有机卤代物中C-X断裂形成相应的羟基化合物的一类酶,产生该酶的微生物可以卤化物为唯一碳源进行生长。1948年,Heppel等[1]首先描述了由微生物产生的能使二氯甲烷水解为甲醛的脱卤酶(命名为烷基脱卤酶EC 3.8.1.1),此后不同类型的脱卤酶相继被发现。20世纪80年代后期,人们从多种环境中筛选得到大量的2-卤代酸脱卤微生物[2]，如Pseudomonassp.、Pseudo-monasputida、Rhizobium等[3-4]。已报道的产脱卤酶微生物可以产生DL-2-卤代酸脱卤酶[4]、D-2-卤代酸脱卤酶[5]和L-2-卤代酸脱卤酶[6-7]三者中的一种,很少有同时产生D-2-卤代酸脱卤酶和L-2-卤代酸脱卤酶[8]的微生物。而繁茂膜海绵共附生假单胞菌DEH138A则可以同时产生D-和L-两种脱卤酶[9]。L-2-卤代酸脱卤酶可以专一性地作用于L-2-卤代酸产生相应的D-2-羟基酸[10],D-2-卤代酸脱卤酶则专一性地作用于D-2-卤代酸产生相应的L-2-羟基酸[11]。

根据酶的合成方式和存在时间,微生物细胞内的酶可分为组成型和诱导型。Janssen等[12]发现，XanthobacterautotrophicusGJ10可以产生组成型表达的脱卤酶，但已知的脱卤酶产生菌中,大多数产生的都是诱导型脱卤酶, 如PseudomonasstutzeriDEH130[13]、Pseudomonassp.strain CBS3[14]等。目前，很多微生物的产酶机制尚不清楚,脱卤酶的诱导作用也存在着争议[15]。海洋假单胞菌DEH138A可以DL-2-氯丙酸(DL-2-CPA)、D-2-氯丙酸(D-2-CPA)和L-2-氯丙酸(L-2-CPA)为唯一碳源进行生长,并产生两种脱卤酶,即L-2-卤代酸脱卤酶(L-DEX)和D-2-卤代酸脱卤酶(D-DEX),且都为胞内诱导酶。L-DEX已被分离纯化,但酶活性与产量很低。诱导型脱卤酶的活性及产量受多种因素调控[16],如一特定脱卤酶基因的转录受激活子的上游调控元件调控,这些酶的表达是由诱导物激活的,因此，不同的诱导物对脱卤酶的诱导作用不同。本研究中，使用消旋和单一手性的诱导物DL-2-CPA、D-2-CPA和L-2-CPA为唯一碳源和能源培养菌株DEH138A,比较不同构型氯丙酸的诱导特性,探讨手性氯丙酸的诱导机理及其相应构型脱卤酶的产量, 并通过优化培养,实现单一构型卤代酸脱卤酶的定向诱导，旨在为利用该菌生产单一构型的脱卤酶奠定基础。

1材料与方法

菌株DEH138A为大连化学物理研究所海洋生物产品工程组筛选得到,经16S rDNA序列比较分析,鉴定为假单胞菌属Pseudomonassp.的菌株DEH138A。菌株保藏在中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC10431。

DL-2-CPA和L-2-CPA为Alfa Aesar公司产品,D-2-CPA为TCI公司产品,其余试剂均为国产分析纯。

1.2.1 培养基的组成

(1)无机盐基础培养基[17]包含Na2HPO4·12H2O (12 g/L)、NaH2PO4· 2H2O (1 g/L)、NaCl (30 g/L)、Yeast extract (0.1 g/L)、(NH4)2SO4(2.0 g/L)、MgSO4·7H2O (0.1 g/L)。参照文献[18]中的方法,DL-2-CPA固体培养基是在无机盐基础培养基中加入0.04 g/L溴百里酚蓝(作为pH指示剂)、18 g/L琼脂粉和终浓度为10 mmol/L的DL-2-CPA。DL-2-CPA液体培养基则是在无机盐基础培养基中加入终浓度为10 mmol/L的DL-2-CPA。以同样的方法分别配制D-2-CPA、L-2-CPA固体培养基与液体培养基。

(2)2216E培养基[19]包含蛋白胨(5.0 g/L)、酵母浸粉(1.0 g/L)、FeCl3(0.1 g/L)、NaCl (30 g/L),加去离子水至1 L,用1 mol/L NaOH溶液调pH至7.5～7.6,用100 kPa高压灭菌15 min，即为2216E液体培养基。固体培养基需加入18 g/L的琼脂粉。

1.2.2 菌体的培养取-70 ℃下保存的菌种,分别接种于以DL-2-CPA、D-2-CPA和 L-2-CPA (浓度均为10 mmol/L)为唯一碳源的固体培养基上,28 ℃下培养7 d;挑取单菌落接种于2216E 液体培养基中,30 ℃下以220 r/min培养3 d;将来源于不同氯丙酸平板活化后的菌液分别接种于以DL-2-CPA、D-2-CPA和 L-2-CPA (终浓度均为10 mmol/L)为唯一碳源的液体培养基中,于30 ℃、220 r/min条件下培养至氯丙酸降解率≥80%时收集菌体。

1.2.3 粗酶液的制备将发酵液在4 ℃下以6500 r/min离心20 min,收集菌体。菌体用KH2PO4-K2HPO4(50 mmol/L,pH 7.5)洗涤2～3次后,于-80 ℃下过夜冻存。在冰水浴中超声(250 W,超声5 s,间隙5 s,60次为一个循环，共进行3个循环)破碎菌体,4 ℃下以12 000 r/min离心30 min,所得上清即为粗酶液,于-80 ℃下保存备用。

1.2.4 脱卤酶活性的测定 L-2-CPA反应体系(共1 mL)：10 mmol/L的L-2-CPA,100 mmol/L pH为10.0的Glycine-NaOH,100 μL待测酶液。D-2-CPA反应体系(共1 mL)：10 mmol/L D-2-CPA,100 mmol/L pH为7.5的KH2PO4-K2HPO4,800 μL待测酶液。在30 ℃水浴中反应适当时间,加入1%的浓磷酸(纯度为85%)终止反应。于4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，去除沉淀。酶活性通过HPLC检测氯丙酸的减少量来表示。

酶活单位定义为:每分钟催化转化1 μmol 氯丙酸或生成1 μmol Cl-所需要的酶量为1 个酶活力单位(U)。

2结果与分析

2.1不同培养方式下脱卤酶的活性

从表1可见，不同培养方式下，D-DEX和L-DEX酶活性有明显差异。DEH138A在L-2-CPA平板复苏、D-2-CPA摇瓶中发酵培养时,得到的D-DEX酶活性最高，为3.23×10-3U/mL(培养基);9种培养方式下,D-DEX酶活性大小顺序为L-D>L-DL>DL-DL>L-L>DL-D>D-L>DL-L>D-D>D-DL,而DL-D、 D-L、DL-L、D-D、D-DL培养基之间D-DEX酶活性的变化幅度为0.10×10-4～2.70×10-4U/mL(培养基),可近似认为酶活性大小相当。不同培养方式下,L-DEX酶活性大小顺序为L-L>L-D>L-DL >D-DL>DL-L>D-D>DL-DL>DL-D>D-L;DEH138A在L-2-CPA平板复苏、L-2-CPA摇瓶中发酵培养时,获得的L-DEX酶活性最高，为6.11×10-2U/mL(培养基),此时D-DEX酶活性则为0.72×10-3U/mL(培养基)。L-L培养方式下，L-DEX酶活性/D-DEX酶活性的数值最高，为85,是常规培养方式DL-DL的8.5倍,实现了L-DEX的定向诱导。

2.2种子培养碳源和发酵培养碳源对酶活的影响

从表1可见：以D-2-CPA为发酵碳源,用不同种子碳源培养时，D-DEX酶活性大小为L-2-CPA>DL-2-CPA>D-2-CPA，发酵碳源为DL-2-CPA和L-2-CPA时,D-DEX酶活性大小分别为L-2-CPA>DL-2-CPA>D-2-CPA和L-2-CPA>D-2-CPA>DL-2-CPA；以发酵碳源为D-2-CPA时,用不同种子碳源培养时，L-DEX酶活性大小为L-2-CPA>D-2-CPA>DL-2-CPA，发酵碳源为DL-2-CPA和L-2-CPA时,L-DEX酶活性大小分别为L-2-CPA>D-2-CPA>DL-2-CPA和L-2-CPA>DL-2-CPA>D-2-CPA。可见,无论对于L-DEX还是D-DEX,当以L-2-CPA为种子碳源培养DEH138A时,两者的酶活性都比较高,而用D-2-CPA、DL-2-CPA都不如用L-2-CPA作为种子培养碳源效果好。

通过分析发酵培养时不同碳源对两种酶活性的诱导结果,可以发现，对于L-DEX,以L-2-CPA作为发酵培养碳源时比较好,而对于D-DEX，规律则不明显,推测这可能与D-DEX本身活性低、产量少有关。

为了获得更高活性的脱卤酶,要以L-2-CPA而不是DL-2-CPA或者D-2-CPA作为种子碳源来培养菌株DEH138A。至于发酵碳源的类型,则需要根据想要获得的酶的构型选择。

Tab.1EffectsofcarbonsourcesinculturemediaonD-2-haloaciddehalogenase(D-DEX)andL-2-haloaciddehalogenase(L-DEX)activities

注：培养方式中L-D,L代表L-2-CPA,D代表D-2-CPA,L-D培养方式即菌株先用L-2-CPA平板复苏,然后用D-2-CPA摇瓶发酵培养，其他培养方式表示与此类似

Note: The L-D represents cultivation patterns,L is L-2-CPA,D is D-2-CPA,and L-D means the fact that DEH138A is activated in L-2-CPA media,and then ferments in D-2-CPA flask. Other expressions of cultivation ways are similar with L-D

2.3诱导物的诱导特性

从表1可见,没有一种培养方式可以使两种脱卤酶同时达到最高活性,不同培养方式对脱卤酶活性的影响说明DL-2-CPA、D-2-CPA和L-2-CPA对菌株DEH138A两种脱卤酶的产生有不同的诱导特性。以L-2-CPA同时作为种子培养与发酵培养碳源时得到的L-DEX酶活性最高,与常规的DL-DL培养方式相比,其活性提高了5.1倍。而以L-2-CPA为种子培养碳源、D-2-CPA为发酵培养碳源时,获得的D-DEX酶活性最高,与常规的DL-DL培养方式相比,其活性只提高了2.3倍。相对来说,L-2-CPA可以定向诱导L-DEX的产生。而对于D-2-CPA,无论其作为种子碳源还是发酵碳源,获得的L-DEX酶活性都要高于D-DEX酶活性,这可能与L-DEX在自然界广泛存在有关。

3讨论

已知海洋假单胞菌DEH138A可产生两种诱导型卤代酸脱卤酶D-DEX与L-DEX,但产量都非常少,且D-DEX酶活性明显低于L-DEX酶活性,从而给两种酶的分离纯化带来了困难。为探讨不同构型脱卤酶被诱导产生与手性氯丙酸的诱导选择性机理,本研究中分别使用DL-2-CPA、D-2-CPA和L-2-CPA为种子培养和发酵培养碳源来复苏和培养菌株DEH138A。

在诱导型脱卤酶的产生过程中,诱导物起着关键作用,有的为易降解的底物[13],有的则为难降解的底物[16],也有的是菌株不能降解的卤代物,而非卤代物作为唯一碳源时却不能诱导酶的产生[20],这可能与菌株降解卤代物的广谱性有关。Lin等[16]用氯乙酸作为种子碳源培养氯乙酸脱卤酶产生菌Pseudomonassp.MW6,然后接种于不同碳源条件下发酵,确定出发酵时最佳诱导物为其最难降解的底物。这一特性与D-DEX的产生相类似,当以L-2-CPA为种子培养碳源、D-2-CPA为发酵培养碳源诱导DEH138A时,获得的D-DEX酶活性最高。由于菌株DEH138A可以产生两种具有手性选择性的脱卤酶,所以使用手性底物作为诱导剂,来探索手性底物对相应构型酶的诱导机理。可以发现，L-2-CPA可专一性地诱导L-DEX的产生,菌株DEH138A在培养过程中能够降解L-2-CPA，说明其细胞内必然产生某种物质来代谢该底物,而L-2-CPA只有在L-DEX的催化下转化为乳酸后才能被菌株DEH138A吸收利用,因此，在L-2-CPA的诱导下可以获得更多的L-DEX。对于D-2-CPA则没有表现出这样的专一性,若以L-2-CPA专一性诱导L-DEX产生的机理来解释,理论上以D-2-CPA为种子培养和发酵培养碳源时所诱导的D-DEX酶活性最高,但实际上却是以L-2-CPA为种子培养碳源、D-2-CPA为发酵培养碳源时,获得的D-DEX酶活性最高。虽然也有人用不同手性的氯丙酸诱导过产D-DEX和L-DEX的Pseudomonassp.S3[21],但其并未提及单一手性氯丙酸对相应构型酶的影响及相应的诱导机理。

用D-2-CPA、L-2-CPA和DL-2-CPA诱导DEH138A后获得的D-DEX酶活性不同,L-DEX酶活性亦不同。而对可产生顺式-氯丙烯酸脱卤酶与反式-氯丙烯酸脱卤酶的棒杆菌 FG4[22]来讲,无论是经顺式-3-氯丙烯酸还是反式-3-氯丙烯酸的诱导,得到的两种脱卤酶的活性是相似的,这表明两种酶有相同的蛋白调控。对于菌株DEH138A,推测D-DEX与L-DEX可能是由不同蛋白调控,或者可能由同种蛋白调控,但该蛋白更偏向于上调L-DEX的表达。

用氯丙酸的两个对映体及消旋体诱导菌株DEH138A时,发现L-2-CPA可定向诱导L-DEX的产生,但对于D-DEX是怎样被诱导产生的则不清楚,可能是由于L-2-CPA更易被菌株DEH138A利用,从而利于菌株的生长。但是也有菌株在较难利用的种子碳源培养基上培养后,表达的脱卤酶水平反而比易利用的碳源培养时要高,如XanthobacterautotrophicusGJ10,该菌株产生组成型的卤代烷脱卤酶和单氯乙酸脱卤酶[23-26],Torz等[26]使用柠檬酸、二氯乙烷和LB培养基培养GJ10菌株,然后接种于以单氯乙酸为唯一碳源的发酵培养基中发酵,结果发现，来自二氯乙烷培养基的种子在发酵培养中最先进入对数期并且可以降解更高浓度的单氯乙酸,这可能与单氯乙酸脱卤酶是组成型酶有关。从两株菌的比较中也可看出,无论是诱导型还是组成型脱卤酶,种子培养与发酵培养时的碳源类型均影响酶的表达。本研究结果表明：种子培养中,只有L-2-CPA表现出诱导的专一性;发酵培养中,L-2-CPA与D-2-CPA均表现出专一性的诱导作用。

本研究中只是初步研究了L-DEX与D-DEX被诱导产生的机理,并未考察L-2-CPA与D-2-CPA诱导过程中细胞内哪些物质发生了怎样的变化,对于菌株DEH138A被诱导产生具有选择性脱卤酶的机理有待进一步研究。

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Mechanismofsubstrate-induceddehalogenasesinmarinebacteriumPseudomonasstutzeriDEH138A

(1.Marine Bioproducts Engineering Group, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023,China;2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049,China)

Abstract：The effects of carbon source substrates DL-2-chloropropionic acid(DL-2-CPA), L-2-chloropropionic acid(L-2-CPA) and D-2-chloropropionic acid(D-2-CPA) on induction of 2-haloacid dehalogenases L-2-haloacid dehalogenase(L-DEX) and D-2-haloacid dehalogenase(D-DEX) were studied and culture process was optimized in marine bacteriumPseudomonasstutzeriDEH138A. The residual chloropropionic acid in the reaction system was quantified by HPLC. The L-2-CPA as sole carbon source was shown to specifically induce L-DEX production, with 84 times higher activity than D-DEX. The maximum activities of L-DEX (6.11×10-2U/mL media) and D-DEX (3.23×10-3U/mL media) were observed under culture condition of sole carbon source of L-2-CPA, 5.1 times and 2.3 times as the induction of DL-2-CPA. The findings indicate that L-2-CPA shows specificity for directional induction of L-DEX. For D-DEX, however, it is not explained by the mechanism of L-DEX which is induced by corresponding substrate, and the induction of D-DEX needs to be further studied.

Key words：Pseudomonasstutzeri; dehalogenases; chloropropionic acid; induction

基金项目：国家“973”重点基础研究发展计划项目(2009CB724700);中国科学院百人计划项目(A1097)；国家自然科学基金资助项目(31100092)