· )和DPPH·的清除能力。结果表明：PⅠ、PⅡ对
和DPPH·均具有一定的清除作用，其抗氧化活性均随着多糖浓度的增大逐渐增强。研究表明，采用热水索氏法提取得到的多糖PⅠ对3种自由基的清除率均强于采用碱水渗漉法提取得到的多糖PⅡ。摘要：分别采用热水索氏法和碱水渗漉法提取多棘海盘车Asteriasamurensis的多糖组分，将提取的粗多糖经三氯乙酸法脱蛋白、离心透析、冻干，分别得到多糖样品PⅠ、PⅡ，并分析了多糖PⅠ、PⅡ在体外对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基· )和DPPH·的清除能力。结果表明：PⅠ、PⅡ对和DPPH·均具有一定的清除作用，其抗氧化活性均随着多糖浓度的增大逐渐增强。研究表明，采用热水索氏法提取得到的多糖PⅠ对3种自由基的清除率均强于采用碱水渗漉法提取得到的多糖PⅡ。
关键词：多棘海盘车；多糖；抗氧化活性
多棘海盘车Asteriasamurensis隶属于棘皮动物门、海星纲、钳棘目、海盘车科，体呈五星型，口面平坦为浅黄色，反口面较隆起，表面附有较多棘刺，为紫红色，是中国北方海域海星的主要品种[1]。近年来，国外科研人员在不同种类的海星中提取到了多种活性成分，如皂苷、甾醇、多糖、蛋白质和氨基酸等，而国内也有越来越多的科研人员开始关注这一领域[2-8]。多棘海盘车是一种可以食用的海星,多糖作为其重要的活性成分，国内对其相关研究的报道较为少见。本研究中，作者探讨了多棘海盘车多糖的体外抗氧化活性，以期为多棘海盘车多糖的进一步研究提供科学依据。
1.1材料
试验用多棘海盘车采自辽宁省大连市黄海海域。1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基(DPPH)、邻苯三酚、邻二氮菲、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸等试剂均为分析纯。
试验仪器主要有：紫外-可见分光光度计(OPTIZEN 2620UV型)、可见分光光度计(721型)、真空冷冻干燥机(SIM FD-5型)等。
1.2方法
1.2.1 多棘海盘车多糖的制备 将多棘海盘车样品于烘箱中恒温(60 ℃)烘干，粉碎后过40目筛备用。采用水提醇沉法进行粗多糖的提取，然后经脱除蛋白及透析法进行多糖的进一步精制[9-11]。
(1)索氏提取法。精确称取多棘海盘车样品，经单因素实验分析，在最佳条件下，加入蒸馏水，料液比为1∶15(g∶mL)，在温度为80～85 ℃下提取6 h，在提取液中加入乙醇，使乙醇含量为80%，离心分离沉淀，得到粗多糖样品A。
(2)碱水渗漉法。精确称取多棘海盘车样品，加入1 mol/L 的NaOH溶液，料液比为1∶15(g∶mL)，在提取液中加入乙醇，使乙醇含量为80%，离心分离沉淀，得到粗多糖样品B。
(3)将粗多糖A、B分别采用三氯乙酸脱除蛋白、透析24 h、冻干，得到多糖样品PⅠ、PⅡ。
1.2.2 对DPPH·的清除作用 分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL PⅠ和PⅡ样品溶液各2 mL，分别加入2 mL 20 μmol/L DPPH溶液，摇匀，于25 ℃下避光反应30 min后，在517 nm处测定吸光度(Ai)，同时测定2 mL样品溶液与2 mL乙醇混合液的吸光度(Aj)，以及未加样品时2 mL乙醇中加入2 mL DPPH溶液的吸光度(Ac)，用抗坏血酸(VC)作为阳性对照，按下式计算DPPH·清除率：
清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。
(1)
1.2.3 清除DPPH·的反应动力学曲线 取2 mL不同浓度的PⅠ、PⅡ样品溶液与2 mL DPPH标准溶液反应，每隔5 min记录一次吸光度值，连续记录30 min，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制不同浓度的样品与DPPH·反应随时间推移的动力学关系曲线图。
1.2.4 对超氧阴离子自由基
的清除作用 采用邻苯三酚自氧化法测定多糖清除
的能力。取浓度为0.8 mg/mL PⅠ、PⅡ样品溶液各1 mL，加入4.5 mL 50 mmol/L pH为8.2的Tris-HCl缓冲液，于25 ℃水浴中保温20 min后，再加入0.5 mL 25 mmol/L邻苯三酚水溶液，摇匀，于25 ℃下保温5 min，用1 mL 8 mmol/L的HCl终止反应，在325 nm处测定吸光度(Ai)；相同条件下不加入邻苯三酚溶液测定吸光度(Aj)，以蒸馏水代替样品溶液测定吸光度(Ac)。用VC作为阳性对照，按式(1)计算清除率。
1.2.5 对羟自由基(·OH)的清除作用 采用Fenton法测定多糖清除·OH的能力。取1.0 mL 7.5 mmol/L邻二氮菲水溶液，加入2.0 mL pH为7.4的磷酸盐缓冲液和1.0 mL 7.5 mmol/L FeSO4水溶液，然后分别加入1.0 mL 0.1% H2O2水溶液(记为s损伤管)、1.0 mL 0.1% H2O2水溶液和1.0 mL浓度为0.8 mg/mL PⅠ、PⅡ样品溶液(记为y样品管)，以不加H2O2和样品液的作为空白管(记为k样品管)。各管均用蒸馏水定容至10 mL，摇匀，于37 ℃下反应1 h，以2.0 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和8.0 mL蒸馏水混合液作空白参照管，于536 nm波长下测定各管液体的吸光度，用VC作为阳性对照，按下式计算·OH清除率：
清除率=(Ay-As)/(Ak-As)×100%。
(2)
2.1PⅠ、PⅡ对DPPH·的清除率
从图1可见：多糖样品PⅠ、PⅡ对DPPH·均有一定的清除作用，且随着多糖浓度的增加清除率也在增高；而VC对DPPH·的清除效果显著高于PⅠ、PⅡ，三者的清除作用趋势总体是相同的。此外，PⅠ对DPPH·的清除效果比PⅡ好，分析其原因，可能是由于PⅠ样品采用蒸馏水作溶剂提取多糖，蒸馏水作为溶剂较温和，能够更好地保留多糖的抗氧化活性。
2.2清除DPPH·的反应动力学研究
从PⅠ、PⅡ清除DPPH·的反应动力学曲线(图2)可见：不同浓度的PⅠ、PⅡ样品对DPPH·的清除效果均随时间的延长而增强；多糖溶液的浓度越高，其吸光度值降低也越快，说明多糖含量越高，清除DPPH·的能力越强。此外，相同浓度的多糖PⅠ对DPPH·的清除能力随时间的延长比PⅡ的效果更显著一些。即用蒸馏水提取的多糖样品抗氧化活性持久度更强，活性更好，这一结论与PⅠ、PⅡ对DPPH·的清除率一致。
图1 PⅠ、PⅡ多糖对DPPH·的清除率
Fig.1 The clearance of DPPH· by polysaccharides PⅠ and PⅡ
图2 PⅠ、PⅡ清除DPPH·的反应动力学曲线
Fig.2 Kinetic curve of DPPH· clearance by PⅠ and PⅡ
2.3PⅠ、PⅡ对
·和·OH的清除率
从图3可见，PⅠ、PⅡ多糖对
·具有一定的清除作用，但PⅠ、PⅡ对· 的清除率均显著低于VC，三者的清除作用均随样品浓度的增大而增大。一般认为，多糖清除活性氧的作用与其富含羟基有关，多糖分子上的还原性半缩醛羟基可与活性氧自由基发生氧化还原作用。此外，PⅠ对· 的清除率比PⅡ高，其原因可能是使用稀碱提取多糖过程中会使某些多糖中的糖苷键断裂，形成单糖，从而降低其活性的表达。该结果进一步说明用不同方法提取的多糖其抗氧化活性也存在差异。
PⅠ、PⅡ对·OH也具有一定的清除作用，均显著低于VC，但清除效果并不显著，且PⅠ、PⅡ对·OH的清除率基本相同。
图3 PⅠ、PⅡ对
的清除率
Fig.
Ⅰ and PⅡ
采用热水索氏法和碱水渗漉法均能从多棘海盘车中提取多糖，提取的多糖PⅠ、PⅡ粗品为黄褐色粉末，可溶性良好，经脱除蛋白、透析精制后的多糖样品为淡黄色粉末，理化性质鉴定结果为阳性。以水溶性VC为对照组，采用Fenton法、邻苯三酚自氧化法、DPPH法检验了PⅠ、PⅡ的体外抗氧化活性。结果表明：PⅠ、PⅡ对
·和DPPH·均有一定的清除作用，但均显著低于VC对照组，其中对DPPH·的清除率最好，对·OH的清除效果不明显，而PⅠ对·、DPPH·的清除率均显著高于PⅡ。多棘海盘车多糖对3种自由基的清除率均低于龙须菜、鼠尾藻等海洋植物多糖[10，12]。多棘海盘车一般属于废弃资源，本研究中对其多糖抗氧化活性的研究可为海星资源的进一步开发利用提供参考。
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Abstract：The polysaccharides PⅠand PⅡwere extracted from starfishAsteriasamurensisby hot water soxhlet extraction and alkaline percolation extraction method, and centrifuged, dialyzed and freeze-dried by TDA. The clearance of hydroxyl radicals (·OH),superoxide anion radical
· ) and DPPH· radical contents by the polysaccharides PⅠand PⅡ was studied in vitro to evaluate antioxidant activity of the polysaccharides components from the starfish. It was found that the polysaccharides PⅠand PⅡ showed certain clearance capacity of
· and DPPH· and the antioxidant activity was enhanced with the elevated polysaccharide concentrations. There were higher free radical clearance rate in the polysaccharide PⅠextracted by soxhlet method of hot water than in the polysaccharide PⅡextracted by alkaline percolation method.
Key words：Asteriasamurensis; polysaccharide; antioxidant activity
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.03.016
文章编号：2095-1388(2014)03-0281-03
收稿日期：2013-09-09
基金项目：国家自然科学基金资助项目(31300289)
中图分类号：R285
文献标志码：：A