摘要：以体质量为(72.51±1.46)g的杂交鳢(斑鳢Channamaculata♀×乌鳢Channaargus♂)为试验对象，用基础饲料中添加不同质量分数(0、5.0%、7.5%、10.0%)的赤子爱胜蚓Eiseniafoetida新鲜浆液配制的试验饲料进行投喂，养殖试验共进行100 d，研究赤子爱胜蚓作为饲料添加剂对杂交鳢血液部分免疫指标的影响。结果表明：10.0%蚯蚓组杂交鳢的红细胞数(RBC)最多，且与其他各组有显著性差异(P<0.05)，对照组的红细胞数最少；杂交鳢的白细胞数量(WBC)随着蚯蚓添加量的增加呈上升趋势，且各组之间均存在显著性差异(P<0.05)；添加蚯蚓的各组杂交鳢血清总蛋白含量(TP)与对照组均无显著性差异(P>0.05)；杂交鳢血清溶菌酶(LZM)和酚氧化酶(PO)活性随着蚯蚓添加量的增加呈上升趋势，10.0%蚯蚓组最高，且与其他各组有显著性差异(P<0.05)；杂交鳢血清酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(AKP)活性均随着蚯蚓添加量的增加出现波动，7.5%蚯蚓组3种酶活性均最高，且与对照组有显著性差异(P<0.05)。本研究表明，在饲料中添加7.5%和10.0%赤子爱胜蚓的新鲜浆液，能提高杂交鳢血液中红细胞和白细胞的数量，提高血清中的LZM、ACP、AKP、SOD和PO活性。
关键词：赤子爱胜蚓；杂交鳢；免疫指标；血细胞
杂交鳢是以斑鳢Channamaculata为母本、乌鳢Channaargus为父本杂交繁育所得的F1代，又称闽香鳢[1]。杂交鳢具有生长速度快、抗逆性强、成活率高、养殖周期短、产量高等优点，杂种优势明显。杂交鳢易驯食人工配合饲料，可有效减少乌鳢冰鲜鱼饲养模式及频繁换水导致的农业水源污染[2-3]。但是,随着杂交鳢养殖面积的不断扩大，杂交鳢养殖业也面临着许多问题,如肉质变差、免疫力下降、病害发生率高等，这些问题均与杂交鳢饲料有着密切关系。
蚯蚓中医学上又称地龙，是宝贵的中药材之一，其体内含有地龙素、地龙解热素、黄嘌呤、抗组胺、胆碱、核酸衍生物、B族维生素等多种药用成分，具有活血化瘀、清热解毒、提高机体免疫力的作用，广泛用于细菌与病毒的感染性疾病和免疫性疾病的治疗[4-5]。目前，已有蚯蚓对多种鱼类免疫指标影响的研究报道，如罗非鱼[6]、改良鲫[7]、虹鳟[8]、异育银鲫[9]、中国明对虾[10]、凡纳滨对虾[11]等。本试验中，选择以赤子爱胜蚓Eiseniafoetida作为鲜活饵料，研究其与人工饲料的不同配比对杂交鳢血液部分免疫指标的影响，旨在为蚯蚓添加剂的合理使用以及养殖鱼类疾病的预防提供参考依据。
1.1材料
试验用鱼取自中山市三角镇裕荣水产繁殖场自繁自育的杂交鳢，体质量为(72.51±1.46)g，体长为(17.2±1.01)cm，挑选体质健壮、大小均匀的杂交鳢360尾用于试验。
试验用蚯蚓为鲜活赤子爱胜蚓，取自华南农业大学动物科学学院蚯蚓饲养基地，蚯蚓体色暗红，体质健康，体长为4～7 cm。
1.2方法
1.2.1 试验设计与试验饲料 试验共分4组，每组设3个重复。以其中1组为对照组(记为D组)，投喂不添加蚯蚓的基础饲料，其他3组为试验组(分别记为S1、S2、S3组)，分别投喂含鲜蚯蚓5.0%、7.5%、10.0%(本试验蚯蚓干质量占鲜质量的平均百分比为15%)的饲料。试验饲料在韶关市可利鲜生物科技有限公司加工制成膨化料。基础饲料配方组成及主要营养成分见表1。
表1基础饲料配方及营养水平(风干基础)
Tab.1Ingredientsandnutritionallevelsofbasaldiet(air-drybasis)
组别group原料ingredient/%沸石粉zeolitepowder蚯蚓(干)∗earthworm(dry)营养成分nutrientcomposition/%干物质drymatter粗蛋白crudeprotein粗脂肪crudelipid粗灰分crudeash粗纤维crudefiber饲料能量/(kJ·g-1)feedenergyD1 50089 8440 636 039 345 4017 06S10 750 7589 4440 936 279 335 6217 02S20 3751 12589 2140 316 209 285 1017 11S31 501 5088 8640 696 139 264 4417 09
注：(1)原料(%)中还包括鱼粉22.5、肉粉5、鲜虾粉5、豆粕17.5、花生粕10、菜粕2.5、面粉27、玉米蛋白粉5、精炼鱼油2、多维多矿2；(2)每千克多维多矿包含维生素A 75×104IU、维生素D315×104IU、维生素E 14 g、维生素K3325 mg、维生素B11500 mg、维生素B21250 mg、维生素B61100 mg、维生素B124 mg、维生素C 2.5 g、肌酸 5.5 g、烟酸 4 g、泛酸 4.5 g、叶酸 70 mg、生物素 125 mg、胆碱 150 g、镁 45 g、铁 15 g、铜 0.35 g、锌 3 g、锰 1.5 g、碘 50 mg、硒9 mg、钴 11 mg、磷 105 g、钙 330 g；(3)*表示饲料加工时未添加，饲喂前人工拌入饲料，数据为鲜蚯蚓折算值；(4)将加入鲜蚯蚓浆制成的饲料经风干后统一进行营养成分测定
Note:(1)The test diets containing(%): fish meal 22.5, meat meal 5,fresh shrimp meal 5,soybean meal 17.5, peanut meal 10,rapeseed meal 2.5,flour 27,corn protein powder 5,fish oil 2，vitamin and mineral premix 2;(2)one kilogram of vitamin and mineral premix containing： VA 75×104IU，VD315×104IU，VE 14 g，VK3325 mg，VB11500 mg，VB21250 mg，VB61100 mg，VB124 mg，VC 2.5 g，creatine 5.5 g，nicotinic acid 4 g，pantothenic acid 4.5 g，folic acid 70 mg，biotin 125 mg，choline 150 g，Mg 45 g，Fe 15 g，Cu 0.35 g，Zn 3 g，Mn 1.5 g，I 50 mg，Se 9 mg，Co 11 mg，P 105 g，Ca 330 g；(3)*represents the feed processing without any earthworm, adding the fresh earthworm while feeding, and the data are reduced value of the fresh earthworm；(4)the nutrients of the feed supplemented with fresh earthworm is determined after air dried
1.2.2 饲养管理 试验在广州市白云区耀昌水产繁育场12个网箱(2 m×2 m×1.5 m)中进行，为防止杂交鳢跳出网箱，网箱上有网箱盖，网箱保持1 m水深，每个网箱放30尾鱼。试验开始前用基础饲料驯养杂交鳢15 d，以适应环境和试验饲料。试验开始后，每天10：00、16：00投喂，投喂量为鱼体质量的2%～4%。准确称量每天投喂的饲料质量。把鲜蚯蚓用20 mg/L的高锰酸钾消毒2 min，再用清水冲干净并沥水5 min，然后准确称量并加少量清水一起放入豆浆机中打成浆，和预先称好的饲料混合制成含蚯蚓5.0%、7.5%、10.0%的饲料。而后用空调在18 ℃下抽湿4 h，把制作好的饲料贴上标签，置于冰箱(-20 ℃)中保存备用。试验时间从2013年2月17日—2013年5月28日，共饲养100 d。
1.2.3 指标的测定 试验结束后，从每个网箱随机取5尾鱼，从尾静脉取血，以EDTA-二钾抗凝的鱼血，收集到离心管中，用于血细胞计数；另以肝素钠抗凝的鱼血，静置4 h后，以3000 r/min离心10 min，取上层血清于-80 ℃下保存备用，用于测定杂交鳢血清免疫指标。各血清指标免疫指标测定试剂盒购自南京建成生物技术有限公司。
红细胞(RBC)：取20 μL抗凝血用0.8%生理盐水稀释200倍后，在Neubauer计数板上计数。
白细胞(WBC)：取20 μL抗凝血加入盛有380 μL白细胞稀释液(98 mL蒸馏水中加入冰醋酸1.5 mL和1%龙胆紫1 mL)的试管中，混匀，在Neubauer计数板上计数。
血清总蛋白(TP)：采用考马斯亮蓝法测定，其计算公式为
血清总蛋白含量(g/L)=(测定管OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度(g/L)。
溶菌酶(LZM)：采用比浊法测定，其计算公式为
溶菌酶含量(μg/mL)=(测定管透光度UT2-测定管透光度UT0)/(标准管透光度ST2-标准管透光度ST0)×标准管浓度(2.5 μg/mL)×样本测试前稀释倍数。
酸性磷酸酶(ACP)：100 mL血清在37 ℃下与基质作用30 min，产生1 mg酚为一个ACP酶活力单位(U)。
碱性磷酸酶(AKP)：采用酶标仪法测定。以100 mL血清在37 ℃下与基质作用15 min，产生1 mg酚为一个金氏单位。
超氧化物歧化酶(SOD)：采用黄嘌呤氧化酶法测定。以每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD酶活力单位(U)。
酚氧化酶(PO)：以L-多巴(L-二羟苯丙氨酸)为底物，在pH为6.0的试验条件下每分钟OD490 nm增加0.001，定义为一个酶活力单位(U)。
1.3数据处理
试验数据采用平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan法进行多重比较，显著性水平设为0.05。
2.1各组杂交鳢血细胞数量的变化
从表2可见：10.0%蚯蚓组杂交鳢的红细胞数最多，5.0%蚯蚓组次之，对照组的红细胞数最少，除对照组与7.5%蚯蚓组无显著性差异外(P>0.05)，其他各组之间均存在显著性差异(P<0.05)；杂交鳢的白细胞数随着蚯蚓添加量的增加而增加，且各组之间均存在显著性差异(P<0.05)。试验结果表明，饲料中添加蚯蚓能增加杂交鳢血液的红细胞和白细胞数量。
2.2各组杂交鳢血清非特异性免疫指标的变化
从表3可见：杂交鳢血清TP含量随着蚯蚓添加量的增加先降低后升高，7.5%蚯蚓组最低，但各蚯蚓添加组与对照组均无显著性差异(P>0.05)；杂交鳢血清中的LZM活性随着蚯蚓添加量的增加呈上升趋势，10.0%蚯蚓组显著高于其他各组(P<0.05)，而其他各组之间均无显著性差异(P>0.05)；杂交鳢的ACP活性，7.5%蚯蚓组显著高于其他各组(P<0.05)，而10.0%蚯蚓组显著低于对照组和7.5%蚯蚓组(P<0.05)；杂交鳢的AKP活性随着蚯蚓添加量的增加先降低后升高，5.0%蚯蚓组显著低于其他各组(P<0.05)，7.5%蚯蚓和10.0%蚯蚓组显著高于对照组(P<0.05)；杂交鳢的SOD活性随着蚯蚓添加量的增加呈升高趋势，7.5%和10.0%蚯蚓组显著高于对照组(P<0.05)，而5.0%蚯蚓组与对照组无显著性差异(P>0.05)；杂交鳢血清PO活性随着蚯蚓添加量的增加先降低后升高，10.0%蚯蚓组显著高于其他各组(P<0.05)，但5.0%、7.5%蚯蚓组与对照组无显著性差异(P>0.05)。试验结果表明，在饲料中添加10.0%蚯蚓能显著提高杂交鳢血清的LZM、AKP、SOD和PO的活性(P<0.05)；添加7.5%蚯蚓能显著提高杂交鳢血清的ACP、AKP和SOD活性(P<0.05)；添加5.0%蚯蚓能显著降低杂交鳢血清的AKP活性(P<0.05)，但对LZM、ACP、SOD和PO均无显著性影响(P>0.05)。
表2赤子爱胜蚓对杂交鳢血细胞数量的影响
Tab.2EffectofearthwormEiseniafoetidaonthemunberofbloodcellsinhybridsnakehead
组别group蚯蚓添加量/%addtivequantity红细胞RBC/(×109个·mL-1)白细胞WBC/(×108个·mL-1)D03 14±0 21a0 87±0 09aS15．03 91±0 23b1 18±0 14bS27．53 34±0 08a1 53±0 08cS310．04 58±0 04c2 66±0 04d
注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同
Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia
表3赤子爱胜蚓对杂交鳢血清非特异性免疫指标的影响
Tab.3EffectofearthwormEiseniafoetidaonsomebloodimmuneindexesinhybridsnakehead
组别group总蛋白TP/(mg·mL-1)溶菌酶LZM/(μg·mL-1)酸性磷酸酶ACP/(U·mL-1)碱性磷酸酶AKP/(U·mL-1)超氧化物歧化酶SOD/(U·mL-1)酚氧化酶PO/(U·mL-1)D41 84±3 92a201 90±15 28a6．6493±0．5086b0．0433±0 0081b126 05±2 63a293 33±23 63abS141 08±3 10a222 86±18 57a6．0990±0．2034ab0．0143±0 0014a130 17±2 41a275 00±25 98aS240 84±1 25a230 48±3 30a7．8142±0．3099c0．0630±0 0076c154 49±32 63b333 33±5 77bS341 62±1 75a270 48±3 30b5．3507±0．5804a0．0544±0 0072c150 68±20 08b388 33±20 21c
3.1赤子爱胜蚓对杂交鳢血细胞数量的影响
血液中某种血细胞的含量通常与其生理功能的活性相关。林光华等[12-13]、杨严鸥等[14]认为，运动能力强的鱼类较运动能力弱的鱼类有较多的血红蛋白。同时，红细胞数与血红蛋白含量呈显著的正相关,因此,鱼类的运动能力越强,红细胞数就越多。有学者认为，红细胞是鱼类血液中固有的免疫细胞,其在增强吞噬细胞的吞噬功能、活化适应性免疫细胞、产生特异性免疫反应中起着重要作用[15-16]。刘石林等[11]研究认为，用蚯蚓与人工配合饵料搭配投喂对虾，可显著提高对虾的血细胞数量。本试验中，在饲料中添加鲜赤子爱胜蚓浆，可有效增加杂交鳢的红细胞数量，这与上述研究结果一致。
非特异性免疫包括细胞免疫和体液免疫,在鱼类细胞免疫中,血液中的白细胞起着重要作用,它是机体非特异性免疫的重要组成部分[17],其数量的多少可直接反映鱼类非特异性免疫能力的高低,血液白细胞数量或功能的改变都会引起机体免疫功能的变化。本试验中,杂交鳢血液中的白细胞数量随着蚯蚓添加量的增加而增加，说明饲料中添加鲜蚯蚓浆可以改善杂交鳢机体的免疫功能。
3.2赤子爱胜蚓对杂交鳢血清非特异性免疫相关酶活性的影响
黄林等[18]认为，鱼类血清蛋白的测定在判断鱼类健康、营养和疾病等方面具有重要意义。LZM是存在于鱼类黏液、血清和吞噬细胞中的一种水解酶,可以破坏细菌细胞壁,并可对真菌细胞壁、昆虫外骨骼进行有限的水解,具有抗感染、抗炎症、促吞噬活力和增强抗生素效力等作用。鱼类LZM比高等脊椎动物溶菌酶的杀菌活性强,且随病原的感染或其他胁迫而增强,测定鱼体中的LZM活性，可以在一定程度上反映鱼类的免疫状态[19]。ACP是在酸性条件下催化磷酸单酯水解的酶，主要参与磷酸酯的代谢，此外，其中的一部分ACP还执行一些重要的生物功能，包括代谢调节、能量转化和信号传导等，同时作为溶酶体的标志酶，ACP与溶酶体生理功能的正常发挥密切相关[20]。AKP直接参与磷酸基团的转移，并可参与蛋白质的合成，同时也作为溶酶体酶的重要组成部分，在免疫反应中发挥作用。艾春香等[21]认为，AKP活性的增强加速物质的摄取和转运，为二磷酸腺( ADP ) 磷酸化形成腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)提供更多所需的无机磷，从而起到促生长和增强非特异性免疫功能的作用。SOD活性可作为机体健康状况的反应指标之一，是一切需氧有机体清除超氧阴离子自由基保护机体免受伤害的一种关键酶，其活性与生物的免疫水平密切相关[22-23]。PO在鱼类的防御系统中起着重要的异物识别和防御功能。有学者认为，PO以酶原形式存在于血细胞中，当微生物入侵后刺激血细胞，使该酶释放并激活，它与血细胞的吞噬、包囊，以及血液中的抗菌活性和对外源物质的识别有关[24-25]。
林永贺等[7]研究发现，在饲料中添加5.0%的蚯蚓能提高鲫血清ACP活性(P>0.05)、AKP 活性(P<0.05)，但添加蚯蚓和蚓粪均降低鲫血清SOD 的活性(P>0.05)。刘石林等[11]研究发现，用蚯蚓搭配人工配合饵料投喂对虾，可显著提高对虾血清中LZM、PO活力。本试验结果显示，在饲料中添加7.5%和10.0%赤子爱胜蚓时，杂交鳢血清中LZM、ACP、AKP、SOD和PO的活性能得到不同程度的提高，而添加5.0%赤子爱胜蚓对LZM、ACP、SOD和PO无显著影响。这表明饲料中添加一定量的赤子爱胜蚓有利于提高血清非特异性免疫力，本试验条件下，赤子爱胜蚓的适宜添加量为7.5%和10.0%。
综上所述，在饲料中添加5.0%赤子爱胜蚓的新鲜浆液，对杂交鳢血细胞和非特异性免疫指标无明显影响；但添加量为7.5%和10.0%时均能提高杂交鳢血液中红细胞、白细胞数量，提高血清中的LZM、ACP、AKP、SOD和PO的活性。蚯蚓的成本较高，因此，在本试验条件下建议赤子爱胜蚓的添加量以7.5%为宜。
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Abstract：Hybrid snakehead(Channamaculata♀×C.argus♂) with body weight of (72.51±1.46) g was reared in 12 cages of each 2 m×2 m×1.5 m and fed diets containing 0, 5.0%,7.5%,and 10.0% of fresh earthwormEiseniafoetidaffor 100 days to evaluate the effect of fresh earthworm on certain blood immune indices of the juvenile snakehead. The results showed that there was the maximal red blood cell (RBC) in the fish fed the diet containing 10.0% of earthworm, significant difference from the fish in the other groups(P<0.05), and the minimum in the control group. The number of white blood cell (WBC) was found to be increased with the increasing amount of fresh earthworm, with significant differences among all the groups(P<0.05). No significant difference in total serum protein level was found in the fish between the control group and the test groups(P>0.05). The activities of lysozyme (LZM) and phenoloxidase (PO) in the snakehead serum were increased with the increasing fresh earthworm level, with the maximum in the 10.0% earthworm group, and significant differences from the fish in the other groups(P<0.05). Also, the activities of acid phosphatase (ACP), superoxide dismutase (SOD) and alkaline phosphatase (AKP) were found to be fluctuated with the change in dietary fresh earthworm levels, with the maximum in the 7.5% earthworm group, and significant difference from the control group(P<0.05). The findings indicate that fresh 7.5% and 10.0% earthworm could improve the levels of RBC, and WBC, and activities of LZM,PO, ACP and AKP.
Key words：Eiseniafoetida; hybrid snakehead; immune index； blood corpuscle
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.03.009
文章编号：2095-1388(2014)03-0246-05
收稿日期：2013-08-26
基金项目：广东省部产学研结合项目(2011B090400270)；清远市科技计划项目(2011C011106009)
中图分类号：S917.4
文献标志码：：A