摘要：在实验室条件下模拟养殖污水进行海水小球藻Chlorellavulgaris栽培试验，探索小球藻对污水中氮、磷的去除效果及其生物量增殖的情况。结果表明：小球藻能有效去除污水中的
-N和
-P；当
N浓度为2.0～6.0 mg/L时，去除率在90%以上，-P浓度为0.590 mg/L时，去除率达94.6%；小球藻对-N和-P的去除速率最大分别可达到2.657、0.445 mg/(L· d)；当污水中-N浓度由0.8 mg/L升至10.0 mg/L时，培养72 h后小球藻细胞密度由1.33×107cells/mL 增至2.61×107cells/mL；栽培期间，污水的pH 为8.19～9.74，适合于小球藻生长。研究表明，利用养殖污水栽培小球藻，不仅可以有效地净化污水，还可以获得较大的藻细胞生物量。
关键词：小球藻；养殖污水；氮； 磷；生物量
近年来，水产养殖规模不断扩大，富含N、P的养殖污水排放造成了严重的环境污染。因此，如何实现养殖污水有效净化和废N、P的资源化利用，是水产养殖业进一步发展面临的重要课题[1]。已有研究表明，藻类能有效去除养殖污水中的氮、磷[2-3]，同时收获的藻类可作为鱼类饵料、食品原料或生物质原料制备生物能源[4-5]。李秀辰等[6]利用孔石莼净化鲍鱼养殖污水，发现3 h时对
-N的去除率达70.1%；Huo等[7]将龙须菜与大黄鱼混合培养6周，得出龙须菜对养殖污水中-N和
-P的最大去除率分别为61%和58%，藻类生物量增长了42倍；Marinho-Soriano等[8]用江蓠属藻类处理养虾废水，培养4周后对-N和-P的去除率分别为34.0%和93.5%，藻类生物量的相对增长率为2.6%/d。
小球藻分布广泛，易于培养[9]，对富含氮、磷的污水具有明显的净化效果。Tones等[10]、岳维忠等[11]比较了多种藻类的净水效果，认为小球藻是去除N、P的优势藻种之一。另有研究表明，净水后收获的小球藻不仅是鱼、虾、贝类等幼体的优质饵料[12]，亦是提取蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等物质和制备生物能源的重要原料[13-14]。目前，对小球藻净化养殖污水的效率和藻细胞生物质生产潜力方面的系统研究报道较少。本研究中，通过人工配制营养盐，模拟不同N、P浓度的养殖污水进行小球藻栽培试验，探索小球藻对污水中N、P的去除效果及其在污水中生物量的增殖情况，旨在为净化养殖污水及生物质原料栽培技术的开发提供参考。
1.1材料
海水小球藻Chlorellavulgaris购于大连汇新钛设备开发有限公司。试验以f/2培养基为基础，以3 g/L NH4Cl和0.5 g/L KH2PO4溶液为营养盐。培养容器为1 L的三角烧瓶，经洗液洗涤、晾干、高温消毒后备用。试验用环境箱为GTOP系列智能光照培养箱(温度为0～50 ℃，光照度为0～5500 lx)，离心机为TGL-16M高速台式冷冻离心机(转速为0～16 000 r/min，温度为-20～40 ℃)。
1.2方法
1.2.1 试验设计 将500 mL处于对数生长期的小球藻藻液接种于1 L三角烧瓶中，初始接种量为6.4×106cells/mL、pH为8.0左右；培养基中
初始浓度设置为0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L，按N∶P的摩尔比为15[15]添加
，即的浓度为0.118、0.148、0.295、0.590、0.886、1.181、1.476 mg/L，每个处理设3个平行。在智能光照培养箱中培养72 h，培养期间光照强度为3000 lx[16]，温度为20 ℃，光暗比为12∶12，每天定时摇动3次。
1.2.2 N、P浓度和pH的测定 取40 mL小球藻藻液以8000 r/min离心10 min，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后待测。分别采用纳氏试剂光度法、磷钼蓝分光光度法测定
-N和
-P含量[17]。采用雷磁PHS-2F型pH计测定小球藻藻液的pH。
1.2.3 藻细胞生物量的测定 用UV-7504单光束紫外-可见分光光度计测定小球藻藻液在波长680 nm处的吸光度值(A680 nm)[18]，并用血球计数板计数藻细胞。
的去除特性
从图1可见：当污水中-N浓度分别为0.8、1.0、2.0 mg/L时，试验开始后-N浓度迅速下降，12 h时去除率分别为61.1%、66.2%和76.9%，12 h后小球藻对-N的吸收速度降低，污水中-N浓度呈缓慢降低趋势，72 h时对-N的去除率分别为80.9%、86.7%和90.9%；当-N浓度分别提高到4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L时，在24 h内，小球藻对-N保持较高的吸收速度,24 h时对-N的去除率分别为88.9%、83.5%、69.5%和55.7%，随后-N浓度下降比较缓慢，72 h时去除率分别为91.1%、90.9%、85.2%和77.1%。试验结果表明，小球藻对污水中的-N具有显著的净化效果，不同浓度的污水经小球藻净化72 h后，对-N的去除率均在77%以上，特别是-N浓度为2.0～6.0 mg/L时， 小球藻对-N的去除效果最好(去除率均在90%以上)；当-N浓度达到10.0 mg/L时，小球藻对-N的去除效果明显下降(77%左右)。一方面是由于污水中的-N浓度过高时，超过了小球藻的正常生长需求，抑制了小球藻的生长[8]；另一方面随着-N浓度的增加，藻细胞密度快速增长至较高水平，导致光穿透能力减弱，从而降低了小球藻对-N的吸收效果[19]。由于养殖污水中-N浓度一般在3.0 mg/L左右，因此，利用小球藻净化养殖污水中的-N具有比较明显的优势。此外，本试验中小球藻对模拟养殖污水中-N的净化效果优于对其他污水的净化效果。Valderrama等[20]用小球藻去除乙醇和柠檬酸生产污水
-N浓度为3～8 mg/L)中的-N时，去除率仅为72%。
图
-N浓度随小球藻培养时间的变化
Fig.1 Variation in-N concentrations with culture time
的去除特性
从图2可见：随着小球藻培养时间的延长，污水中-P浓度均呈下降趋势，且在12 h内
P浓度下降最为显著，之后，小球藻对污水中-P的吸收作用明显减弱。但是，不同P浓度条件下，小球藻对-P的去除效果具有一定差异。当污水中-P浓度分别为0.118、0.148、0.295 mg/L时，经小球藻吸收净化12 h时，对污水中-P的去除率分别为52.1%、59.8%和70.5%，小球藻培养时间为72 h时，对
的去除率分别为87.3%、82.1%和89.0%；当-P浓度分别提高到0.590、0.886、1.181、1.476 mg/L时，小球藻培育12 h时，对污水中-P的去除率分别为69.5%、60.4%、59.6%和57.3%，小球藻培养时间为72 h时，对的去除率分别为94.6%、90.4%、85.3%、86.5%。试验结果表明，小球藻能够有效去除污水中的-P，在试验浓度范围内，经小球藻吸收净化72 h时，对污水中-P的去除率均在82%以上，其中-P浓度为0.590 mg/L时，小球藻对-P的净化效果最好，去除率达94.6%。小球藻对-P和-N的吸收规律基本一致，这是由于藻液中N/P约为15，小球藻的分子式为C106H263O110N16P[22](N/P约为16)，二者的N/P比较接近，小球藻生长对N、P的需求导致对-P和-N的去除规律基本一致；另外，由于污水中部分-P会以不溶性磷酸盐的形式沉淀[23]，因而试验中小球藻对-P的去除率较高。Wang等[24]曾利用小球藻净化市政污水，发现当污水中-P浓度为0.46 mg/L时，对-P的去除率为90.1%。
图
-P浓度随小球藻培养时间的变化
Fig.2 Variation in-P concentrations with culture time
2.3小球藻对
和
的去除速率
小球藻对污水中
-P的去除速率可用下式计算[24]：
Ri=-(S0-St)/(t0-tt)。
其中：Ri为或的去除速率[mg/(L· d)]；t0、tt分别为试验开始和结束时的时间(d)；S0、St分别为试验开始和结束时藻液中的或的浓度(mg/L)。
在不同-N浓度的污水中栽培小球藻，小球藻对-P的去除速率见图3。由图3可见，当-N浓度由0.8 mg/L增至10.0 mg/L时，小球藻对-N的去除速率由0.361 mg/(L·d)上升到2.657 mg/(L·d)，但是，当
N浓度大于6.0 mg/L时，小球藻对N的去除速率增加比较缓慢。用SPSS软件将小球藻
N的去除效果进行拟合，得到拟合模型为
y=e1.26 -1.88/x，R2=0.965。
其中：x为-N浓度(mg/L)；y为去除速率。用该模型进行预测(图3)，预测值的绝对误差为0.017～0.843 mg/(L· d)，表明小球藻对-N的去除速率可以由该模型描述。
从图3还可见： 小球藻对-P的去除速率随-P浓度的增加而提高，在本试验条件下，最大去除速率为0.445 mg/(L·d)。同样，小球藻对-P的去除效果可用如下拟合模型来描述：
y=-0.07+0.97x-0.97x2+0.36x3，R2=0.983。
其中：x为浓度(mg/L)；y为去除速率。用该模型进行预测(图3)，预测值的绝对误差为0.002～0.039 mg/(L· d)，表明该拟合模型可靠。
图3 小球藻对-N和-P的去除速率
Fig.3 The removal rate of-N and-P by green alga Chlorella vulgaris
2.4小球藻细胞的生长
根据试验测定结果，得出小球藻细胞密度与藻细胞在680 nm处的吸光度的关系为
y=46.28x-3.93,R2=0.947。
其中：x为OD680 nm；y为污水中的藻细胞密度(106cells/mL)。小球藻初始细胞密度为6.4×106cells/mL，在不同N、P浓度的污水中连续培养72 h，测得的藻细胞生物量随浓度的升高而增加。从图4可见：当污水中浓度由0.8 mg/L升至6.0 mg/L时，藻细胞密度由1.33×107cells/mL提高到2.37×107cells/mL，分别比初始细胞密度增长了1.1～2.7倍；但当-N浓度从6.0 mg/L升至10.0 mg/L时，藻细胞密度仅由2.37×107cells/mL提高到2.61×107cells/mL。可见，在一定范围内，提高污水中-N的浓度，对促进藻细胞的生长比较有利，但当污水中-N浓度超过8.0 mg/L时，继续增加-N浓度对提高小球藻增殖速度的影响不显著。综合分析本试验结果发现，当污水中
N浓度为6.0 mg/L时，比较有利于小球藻细胞的生长。
图4 不同-N浓度下培养72 h后藻细胞的密度
Fig.4 Algal cell density under different-N concentrations in 72 h cultivation
2.5栽培小球藻后污水pH的变化
试验期间，每天从8.00开始记时，每隔12 h测定污水中的pH。从表1可见：在污水中栽培小球藻后，其pH有明显的波动，在不同的
浓度下，第一天8∶00(0 h)时，污水的pH为8.19～8.27，20∶00(12 h)时,污水的pH升至9.16～9.45；次日8：00(24 h)和20：00(36 h)时，污水的pH分别为8.94～9.07和9.59～9.72；试验结束(72 h)时，污水的pH为8.56～8.74。结果表明，试验期间污水pH的范围为8.19～9.74，且每天8∶00时污水的pH值比较低，而20∶00时污水的pH均较高。产生这种现象的原因，可能是白天小球藻进行光合作用消耗了污水中的CO2，促进以下反应向右进行：
↔ CO2+ OH-,
从而导致pH上升[25]。Garcia等[26]研究也表明，藻细胞光合作用能引起藻液pH升高。另外，由于-N作为藻细胞生长的N源时，可使藻液的pH下降[27]，反应式可简单表示为
↔NH3+ H+→ org-N + H+。
且夜间小球藻的呼吸作用不断向水中排放CO2，故从20∶00到次日8∶00污水的pH值呈下降趋势。
表1不同
浓度的污水栽培小球藻后pH的变化
Tab.1VariationinpHinthewastewaterunderdifferent
-Nconcentrationswithculturetime
ρ(NH+4-N)/(mg·L-1)不同培养时间时污水的pH0h12h24h36h48h60h72h0 88 27±0 089 45±0 069 04±0 019 66±0 088 58±0 039 28±0 018 56±0 011 08 22±0 049 48±0 019 07±0 089 72±0 018 69±0 069 66±0 008 74±0 012 08 20±0 069 26±0 009 01±0 019 69±0 088 68±0 029 74±0 018 73±0 044 08 22±0 019 16±0 138 94±0 039 61±0 088 54±0 009 74±0 048 73±0 116 08 19±0 039 17±0 038 96±0 019 60±0 078 54±0 059 71±0 028 72±0 008 08 20±0 119 19±0 048 99±0 049 62±0 018 53±0 019 71±0 068 71±0 0110 08 21±0 089 20±0 049 00±0 039 59±0 018 60±0 039 73±0 038 73±0 01
通过人工配制氮、磷营养盐，模拟不同污染程度的养殖污水栽培小球藻，研究小球藻对污水的净化效果及其在污水中的生长潜力。结果表明:小球藻能有效去除污水中的-N和-P，当N和-P浓度分别为2.0～6.0、0.590 mg/L时，小球藻对-N和-P的去除率分别达90%和94%以上，当污水中-N浓度为10.0 mg/L时，小球藻对-N的去除效果明显下降；小球藻对-N和-P的去除速率随N、P浓度的增加而提高，在试验浓度范围内，小球藻对-N和-P的最大去除速率分别为2.657、0.445 mg/(L· d)；此外，当污水中N浓度为6.0 mg/L时，比较有利于小球藻的生长，72 h后藻细胞密度增长了2.7倍；试验期间，污水中pH保持在8.19～9.74，适合于栽培小球藻。因此，利用养殖污水栽培小球藻，在净化污水的同时，还可以获得较大的微藻细胞生物量。
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Abstract：The removal efficiency of nitrogen and phosphorus wastes and multiplication in biomass in green algaChlorellavulgariswere studied at various nitrogen and phosphorus concentrations. The results showed that
-N and
-P were removed effectively by the green alga for 72 h cultivation, the removal efficiency of above 90% at concentration of 2.0-6.0 mg/L for-N, the removal efficiency of 94.6% at concentration of 0.590 mg/L for-P, and with the maximum value of 2.657 mg/(L·d) in-N and 0.445 mg/(L·d) in-P. Also, the alga had increase from 1.33×107cells/mL to 2.61×107cells/mL in cell density when the concentration of
N was increased from 0.8 to 10.0 mg/L in 72 h cultivation. In the culture medium, the pH value in the wastewater was changed from 8.19 to 9.74 during 72 hours cultivation, indicating that cultivation ofChlorellavulgarisin wastewater would have great potential in water purification and algal production.
Key words：Chlorellavulgaris; aquacultural wastewater; nitrogen; phosphorus; biomass
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.02.019
文章编号：2095-1388(2014)02-0193-05
收稿日期：2013-07-01
基金项目：辽宁省海洋渔业厅科研项目(201304);农业部重点实验室开放研究基金资助项目(201207)
中图分类号：X703
文献标志码：：A