w/%
组别group干物质drymatter粗蛋白质crudeprotein粗脂肪crudefat粗灰分crudeash纤维素cellulose对照组88 5329 232 938 727 18试验组89 5730 033 029 127 18
摘要：在水温为24～33 ℃的条件下，选取初始体质量为(71.1±1.4)g的草鱼Ctenopharyngodonidella300尾，分为试验组和对照组，每组设3个平行。对照组投喂基础饲料，试验组投喂在基础饲料中添加0.1%由地衣芽孢杆菌和低聚木糖配制的合生素，每次投饵量为鱼体质量的3.5%，养殖试验共进行92 d。结果表明：试验组草鱼平均增重率比对照组提高了20.9%(P<0.05)，饵料系数比对照组降低了8.9%(P<0.05)；试验组草鱼的肠道微生物中，大肠杆菌数量比对照组减少了9.4%(P<0.05)，而芽孢杆菌和乳酸杆菌数量则比对照组分别增加了21.6%和7.7%(P<0.05)；试验组草鱼的肠道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分别比对照组显著提高了18.8%、36.8%和19.8% (P<0.05)，肝胰脏中胰蛋白酶和脂肪酶活性分别比对照组显著提高了14.6%和21.3%(P<0.05)，而淀粉酶活性则与对照组无明显差异(P>0.05)。
关键词：草鱼；合生素；地衣芽孢杆菌；低聚木糖；增重率；肠道微生物；消化酶活性
中国水产养殖业广泛采用高密度养殖模式，水产品的病害频繁发生，长期使用抗生素等药物会导致一些病菌出现耐药性，而水产品中残留的药物还会危害人类的健康。因此，寻找出一种安全、高效、无毒的添加剂已成为目前水产饲料添加剂的研究热点。
地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis是芽孢杆菌Bacillussp.中最具应用前景的一种。地衣芽孢杆菌广泛存在于自然界中，具有如下优点：耐热性好，加工后以孢子形式存在，可在饲料中长期保存而不影响饲料品质；生长过程中可以产生多种维生素；能产生多种消化酶，有助于促进胃肠道对饲料的消化吸收；可抑制病原体繁殖，促进益生菌生长等[1-2]。低聚木糖(xylo-oligosaccharide)是寡糖的一种，可以作为益生元，能促进有益菌繁殖，抑制有害菌生长及减少肠内腐败物质,从而提高动物的健康水平[3-4]。益生菌和益生元都能促进动物的生长，由益生菌和益生元组成的微生态制剂称为合生素(synbiotics)。有研究表明,合生素可以更好地改善胃肠道的微生物组成，提高生长速度，两者的协同作用效果比单独添加效果更好[5]。
本研究中，在草鱼Ctenopharyngodonidella饲料中添加由地衣芽孢杆菌和低聚木糖复配成的合生素，研究其对草鱼生长性能、肌肉基本营养成分、肠道菌群和消化酶活性的影响，旨在为合生素在鱼类饲料中的应用提供参考。
1.1材料
试验用草鱼初始体质量为(71.1±1.4)g，购于清远市兴渔水产科技有限公司。
试验菌种的主要成分为地衣芽孢杆菌(含菌量约为2×1010cells/g),由国家大宗淡水鱼类产业技术体系鲤和团头鲂营养岗位提供。低聚木糖产品(含量为35%)由江苏康维生物有限公司提供。将地衣芽孢杆菌菌种和低聚木糖产品按1∶1(质量比)配制成合生素，以便于试验中使用。
1.2方法
1.2.1 试验分组 挑选生长良好、大小均匀的草鱼300尾，随机放入6个大小为2 m×2 m×1.5 m的网箱里，每个网箱放入草鱼50尾。将6个网箱分成试验组和对照组，每组设3个平行。
1.2.2 试验饲料及养殖管理 对照组投喂基础饲料，试验组投喂在基础饲料中添加0.1%合生素(0.05%地衣芽孢杆菌和0.05%低聚木糖)的饲料。每天10:00和16:00分别投喂1次，日投喂量为鱼体质量的3.5%，饲喂量每隔15 d根据鱼体质量调整一次，养殖试验共进行92 d。
养殖期间，水体溶氧为5.5 mg/L以上，水温为24～33 ℃，pH为 6.9～7.2。基础饲料配方(均为质量分数)为：豆粕23%，棉粕20%，菜粕23%，小麦10%，小麦麸10%，DDGS 5%，精炼鱼油0.5%，豆油0.5%，沸石粉1.96%，磷酸二氢钙1%，维生素预混料2%，乙氧基喹啉0.02%，丙酸钙0.02%，海藻酸钠2%。其中每千克维生素预混料包含:VA 75×104IU，VD315×104IU，VE 14 g,VK3325 mg，VB11500 mg，VB21250 mg，VB61100 mg， VB124 mg，VC 2.5 g，肌酸5.5 g，烟酸4 g，泛酸4.5 g，叶酸70 mg，生物素125 mg，胆碱150 g，镁45 g，铁15 g，铜0.35 g，锌3 g，锰1.5 g，碘50 mg，硒9 mg，钴11 mg，磷105 g，钙330 g。试验饲料营养成分见表1。
表1草鱼饲料的营养组成
Tab.1Theapproximatecompositionofthebasicdietsforgrasscarp
w/%
组别group干物质drymatter粗蛋白质crudeprotein粗脂肪crudefat粗灰分crudeash纤维素cellulose对照组88 5329 232 938 727 18试验组89 5730 033 029 127 18
1.2.3 生长指标的测定 养殖试验结束后，停止喂食一天，统计草鱼数量，计算试验组和对照组草鱼的增重率、饲料系数和存活率，其计算公式为
增重率=(终末平均体质量-初始平均体质量)/初始平均体质量×100%，
饲料系数=总摄食量/鱼净增质量，
存活率=终末鱼数/初始鱼数×100%。
1.2.4 基本营养成分的测定 取试验组和对照组鱼的肌肉和饲料，分别采用烘箱干燥法和真空冷冻干燥法测定饲料和肌肉中的水分含量，分别用凯氏定氮仪、索氏提取法、马福炉灼烧(550 ℃)法测定肌肉或饲料中粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量。
1.2.5 消化酶活性的测定 分别从试验组和对照组取10尾鱼于冰盘上解剖，取肠道(去除内容物)和肝胰脏，剔除脂肪组织并冲洗干净，按照质量与体积比为1∶9(g∶mL)加入生理盐水，在0 ℃冰浴下匀浆，取匀浆液于4 ℃下以4000 r/min离心10 min，取上清液于冰箱中(4 ℃)保存，24 h内待测。
草鱼肠道、肝胰脏中的消化酶指标包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，采用Folin-酚法测定蛋白酶，分别采用南京建成生物工程研究所的脂肪酶试剂盒和淀粉酶试剂盒测定脂肪酶和淀粉酶。
1.2.6 肠道特定微生物数量的测定 分别取试验组和对照组各10尾鱼的肠道内容物于冰盘上，用无菌生理盐水将肠道内容物分别稀释10、102、103、104、105、106倍。选取其中3个稀释倍数，用移液枪取100 μL溶液涂布于相对应的筛选培养基上。每克肠道内容物中的菌落数(CFU)=平均菌落数×稀释倍数×10，其中微生物数量单位用lg CFU/g表示。本试验中筛选用培养基及其对应微生物种类、培养条件和稀释倍数如表2所示。
表2草鱼肠道中特定细菌的选择性培养基、培养条件和稀释倍数
Tab.2Theselectivemedium，cultureconditionsanddilutionratioforintestinalmicrofloraingrasscarp
培养基种类culturemedium微生物种类cultureobjects培养条件cultureconditions稀释倍数dilutionratio乳酸杆菌LBS乳酸杆菌有氧37℃，48h103、104、105麦康凯琼脂MAC大肠杆菌有氧37℃，24h104、105、106甘露醇卵黄多粘菌素琼脂MYP芽孢杆菌有氧37℃，24h103、104、105
注：LBS为笔者配制，MAC和MYP由广东环凯微生物科技有限公司提供
Note: LBS for the self-made，MAC and MYP are provided by Guangdong Huankai Microbial Sci.& Tech.
1.3数据处理
试验数据采用平均值±标准误(mean±S.E.)表示(置信区间为0.05)。采用SPSS 19.0软件对试验数据进行方差分析和t检验。
2.1草鱼的生长性能
从表3可见：试验结束时，试验组草鱼的平均增重率比对照组显著提高了20.9%(P<0.05)；试验组草鱼的饵料系数比对照组显著降低了8.9%(P<0.05)；试验组草鱼的存活率比对照组略有提高，但无显著性差异(P>0.05)。
表3饲料中添加地衣芽孢杆菌和低聚木糖组成的合生素对草鱼生长性能的影响
Tab.3EffectsofdietarysynbioticscomprisedofBacilluslicheniformisandxylo-oligosaccharideonweightgainrateandfoodconversionratioingrasscarp
组别group初始体质量/ginitialbodyweight终末体质量/gfinalbodyweight增重率/%weightgain饵料系数foodconversionratio存活率/%survivalrate对照组71 9±1 34274 20±24 11283 20±17 822 58±0 2388 30±1 50试验组70 3±1 50319 87±13 07356 97±18 69∗2 35±0 12∗90 40±1 35
注：*表示与对照组有显著性差异(P<0.05),下同
Note: *means significant difference compared with the control (P<0.05),et sequentia
2.2肌肉营养成分
从表4可见：试验结束时，试验组草鱼肌肉中的水分、粗蛋白质、粗灰分和粗脂肪含量与对照组均无显著性差异(P>0.05)。
表4饲料中添加地衣芽孢杆菌和低聚木糖组成的合生素对草鱼肌肉营养成分的影响
Tab.4EffectsofdietarysynbioticscomprisedofBacilluslicheniformisandxylo-oligosaccharideonmusclenutritioningrasscarp
w/%
组别group水分moisture粗蛋白质crudeprotein粗灰分crudeash粗脂肪crudefat对照组74 24±1 2220 95±0 442 10±0 423 37±0 45试验组73 87±1 0721 21±0 612 04±0 343 61±0 58
2.3肠道微生物菌群数量
从表5可见：试验结束时，试验组草鱼中的大肠杆菌数量比对照组显著减少了9.4%(P<0.05)；而芽孢杆菌和乳酸杆菌数量则比对照组分别显著增加了21.6%和7.7%(P<0.05)。
表5饲料中添加地衣芽孢杆菌和低聚木糖组成的合生素对草鱼消化道微生物菌群数量的影响
Tab.5EffectsofdietarysynbioticscomprisedofBacilluslicheniformisandxylo-oligosaccharideonintestinalmicrofloraingrasscarp
lg CFU/g
组别group大肠杆菌Escherichiacoli芽孢杆菌Bacillussp 乳酸杆菌Lactobacilli对照组7 59±0 313 43±0 155 34±0 14试验组6 12±0 33∗4 17±0 22∗5 75±0 26∗
2.4肠道和肝胰脏中消化酶的活性
从表6可见：试验结束时，试验组草鱼肠道中，胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分别比对照组显著提高了18.8%、36.8%、19.8%(P<0.05)；而肝胰脏中，胰蛋白酶和脂肪酶的活性分别比对照组显著提高了14.6%和21.7%(P<0.05)，淀粉酶活性比对照组略有升高，但无显著性差异(P>0.05)。
表6饲料中添加地衣芽孢杆菌和低聚木糖组成的合生素对草鱼消化酶活性的影响
Tab.6EffectsofdietarysynbioticscomprisedofBacilluslicheniformisandxylo-oligosaccharideondigestiveenzymeactivitiesingrasscarp
组别group肠道intestine胰蛋白酶/(U·mg-1)trypsin淀粉酶/(U·mg-1)amylase脂肪酶/(μmol·g-1)lipase肝胰脏hepatopancreas胰蛋白酶/(U·mg-1)trypsin淀粉酶/(U·mg-1)amylase脂肪酶/(μmol·g-1)lipase对照组1326 83±45 2717 36±1 76128 13±4 71746 35±18 265 95±1 32117 34±5 92试验组1576 59±39 62∗23 75±1 10∗153 50±3 53∗854 92±16 38∗6 10±1 27142 29±4 46∗
3.1饲料中添加合生素对草鱼生长性能的影响
研究显示，芽孢杆菌能显著提高动物肠道黏膜厚度，增加肠道绒毛的高度和细胞密度，并能产生多种消化酶类，有助于改善肠道健康，提高鱼类的生长速度[6-8]，同时，芽孢杆菌还可以显著提高草鱼的增重率和特定生长率[7,9]。
在饲料中添加寡糖有利于提高鱼类对营养物质的吸收，促进肠道益生菌的生长，从而起到促进鱼类生长的作用[10-11]。孙立威等[12]研究发现，壳寡糖能显著提高罗非鱼幼鱼的生长性能，并能显著提高其抗病能力。
有研究表明，益生菌和寡糖搭配使用，比起单独使用益生菌可以更好地提高鱼类的生长性能[13]；刘波等[14]研究发现，在异育银鲫饲料中搭配添加芽孢杆菌和低聚木糖能显著提高其生长性能，且效果比单独添加芽孢杆菌要好。本试验结果表明，在饲料中添加0.1%由地衣芽孢杆菌和低聚木糖制成的合生素可以显著提高草鱼的生长性能，试验组鱼的平均增重率比对照组显著提高了20.9%，饵料系数比对照组降低了8.9%，说明添加合生素对草鱼的消化吸收功能是有明显的提高作用，也证明了饲料中添加由芽孢杆菌和寡糖组成的合生素可以有效提高草鱼的生长性能。
3.2饲料中添加合生素对草鱼肌肉营养成分的影响
钟国防等[15]研究认为，在饲养环境十分相近的条件下，同一种鱼类的肌肉营养成分是比较稳定的，一般不会因为在饲料中加入少量的添加剂而发生显著改变。邱燕等[16]研究发现，在饲料中添加芽孢杆菌对草鱼全鱼和肌肉的水分、粗蛋白质和粗脂肪含量均没有明显影响。曹丹等[17]研究发现，在异育银鲫的饲料中添加壳聚糖，可以显著提高其生长性能，但是对异育银鲫的肌肉营养成分没有显著影响。本试验结果表明，在草鱼饲料中添加0.1%由地衣芽孢杆菌和低聚木糖组成的合生素后，试验组草鱼肌肉中水分、粗蛋白质、粗灰分和粗脂肪含量均与对照组没有明显改变，说明在饲料中添加一定量的由地衣芽孢杆菌和低聚木糖配制的合生素不足以影响草鱼的肌肉营养成分，此结果与上述研究者的结论一致。
3.3饲料中添加合生素对草鱼肠道菌群的影响
鱼类的肠道微生物群落是由多种微生物组成的一个处于动态平衡的整体，不同微生物之间以及微生物与宿主之间存在着十分密切的联系，对宿主的消化吸收、健康状况有重要的影响。研究表明，在饲料中添加芽孢杆菌可以改变鱼类肠道微生物的组成比例，提高益生菌数量，减少大肠杆菌的数量[8,18-20]。
刘波等[14]研究表明，在异育银鲫饲料中添加质量分数为0.02%的地衣芽孢杆菌，可以显著减少异育银鲫大肠杆菌数量，提高芽孢杆菌和乳酸杆菌的数量。刘文斌等[13]研究发现，地衣芽孢杆菌与低聚木糖配伍添加在异育银鲫饲料中，异育银鲫肠道微生物益生菌数量明显多于各自单独添加。本试验结果表明，在草鱼饲料中添加0.1%由地衣芽孢杆菌和低聚木糖组成的合生素后，能使试验组草鱼肠道内容物中大肠杆菌数量比对照组显著减少，而芽孢杆菌和乳酸杆菌的数量显著提高，说明由地衣芽孢杆菌和低聚木糖配制的合生素可以显著改善草鱼肠道的菌群结构。
3.4饲料中添加合生素对草鱼肠道和肝胰脏消化酶活性的影响
Ghosh等[8]研究表明，鱼类胃肠道中益生菌可以分泌多种消化酶，如蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和植酸酶等，其中有些酶是动物肠道本身无法合成的，需要依靠肠道内的细菌来提供。
研究表明，在饲料中添加益生菌可以提高鱼类消化酶的活性[2, 11]。曲艺等[21]在草鱼饲料中添加芽孢杆菌，发现其肠道消化酶活性有显著提高。李卫芬等[22]研究发现，在饲料中添加芽孢杆菌，可以使草鱼肝胰脏和肠道内容物中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性分别比对照组有显著提高。蔡立胜等[10]研究表明，在饲料中添加寡糖类物质能显著提高鮸消化酶活性。本试验结果表明，在草鱼饲料中添加0.1%由地衣芽孢杆菌和低聚木糖组成的合生素，能使试验组草鱼的肠道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性比对照组有显著提高，此结果与上述研究者的结论一致。在本试验草鱼的肝胰脏消化酶指标中，试验组鱼胰蛋白酶和脂肪酶的活性比对照组有显著提高，但是提高程度比胃肠道消化酶提高的程度低；而淀粉酶活性与对照组没有显著性差异，可能是地衣芽孢杆菌和低聚木糖对肝胰脏消化酶的影响不如其对肠道消化酶活性的影响大，但仍然有一定的效果。
参考文献：
[1] 唐娟,张毅,李雷雷,等.地衣芽孢杆菌应用研究进展[J].湖北农业科学,2008,47(3):351-354.
[2] 付天玺,魏开建,许国焕.芽孢杆菌在水产养殖中的研究和应用概况[J].水利渔业,2007,27(3):102-104.
[3] 明建华,刘波,周群兰,等.功能性寡糖在水产动物饲料中的应用[J].水产科学,2008,27(9):490-493.
[4] 王继成,潘灵辉,李淑云,等.低聚木糖对断奶仔猪生产性能、肠道菌群及免疫水平影响的研究[J].中国畜牧兽医,2006,33(5):3-7.
[5] 苗晓微,李娜,吴健,等.合生素的研究进展[J].饲料工业,2005,26(14):6-9.
[6] 余成瑶,郑黎,周毅,等.肉鸡饲喂益生素后小肠粘膜上皮细胞、肝细胞超微结构功能研究[J].四川农业大学学报,1996,14(1):61-66.
[7] 陈南南.饵料中添加芽抱杆菌对草鱼生长的影响及机理探讨[D].杭州:浙江大学,2010.
[8] Ghosh K,Sen S K,Ray A K，et al.Characterization ofBacillusisolated from the gut of rohu,Labeorohita,fingerlings and its significance in digestion[J].Journal of Applied Aquaculture,2002,12(3):33-42.
[9] 沈文英，李卫芬，梁权，等.饲料中添加枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能、免疫和抗氧化功能的影响[J].动物营养学报，2011,23(5):881-886.
[10] 蔡立胜,吴天星,潘晓东,等.肉毒碱和果寡糖对鮸鱼幼鱼消化率影响的研究[J].饲料工业,2007,28(4):25-26.
[11] Yilmaz E,Genc M A,Genc E.Effects of dietary mannan oligosaccharides on growth,body composition,and intestine and liver histology of rainbow trout,Oncorhynchusmykiss[J].Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh,2007,59(3):182-188.
[12] 孙立威,文华,蒋明,等.壳寡糖对吉富罗非鱼幼鱼生长性能、非特异性免疫及血液学指标的影响[J].广东海洋大学学报,2011,31(3):43-48.
[13] 刘文斌,尹君,方星星,等.3种益生素配伍对异育银鲫 (Carassiusauratusgibelio)生长、消化及肠道菌群组成的影响[J].海洋与湖沼,2007,38(1):29-35.
[14] 刘波,谢骏,刘文斌,等.地衣芽孢杆菌与低聚木糖对异育银鲫消化酶活性、肠道菌群及生长的影响[J].大连水产学院学报,2006,21(4):336-340.
[15] 钟国防,周洪琪.木聚糖酶和复合酶制剂PS对尼罗罗非鱼生长性能、消化率以及肌肉营养成分的影响[J].浙江海洋学院学报:自然科学版,2005,24(4):324-329.
[16] 邱燕,叶元土,蔡春芳,等.枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能的影响[J].粮食与饲料工业,2010(10):47-49.
[17] 曹丹,周洪琪.壳聚糖对异育银鲫的生长、蛋白质合成及肌肉营养成分的影响[J].淡水渔业,2004,34(1):6-9.
[18] 付天玺,许国焕,吴月嫦,等.凝结芽孢杆菌对奥尼罗非鱼消化酶活性、消化率及生长性能的影响[J].淡水渔业,2008,38(4):30-35.
[19] 赵庆新,谭远德.鲤科鱼肠道菌分布及共生关系研究[J].中国预防兽医学报,2001,23(2):130-133.
[20] Sugita H,Hirose Y,Matsuo N,et al.Production of the antibacterial substance byBacillussp.strain NM12,an intestinal bacterium of Japanese coastal fish[J].Aquaculture,1998,165(3/4):269-280.
[21] 曲艺,吴志新,杨丽,等.饲料中添加芽孢杆菌对草鱼表观消化率及消化酶活性的影响[J].华中农业大学学报,2012,31(1):106-111.
[22] 李卫芬,沈涛,陈南南,等.饲料中添加枯草芽孢杆菌对草鱼消化酶活性和肠道菌群的影响[J].大连海洋大学学报,2012,27(3):221-225.
Abstract：A total of 300 grass carpCtenopharyngodonidellajuveniles with initial body weight of (71.1±1.4)g were randomly divided into a 2 m×2 m×1.5 m cage and fed basal diet in the control group and the basal diet supplemented withBacilluslicheniformisand xylo-oligosaccharide in the test group at a rate 0.1% at a feeding rate of about 3.5% at water temperature of 24-33 ℃ for 92 days with triplication. The results showed that there were 20.9% weight gain rate and 8.9% lower food conversion ratio compared with the control group, weight rate in the test group than those in the control group, with significant difference (P<0.05).The number ofBacillussp. in the intestine was found to be decreased by 9.4% in the test group while the number ofBacilluslicheniformisandLactobacillussp. was found to be increased by 21.6% and 7.7%, respectively, with significant differences (P<0.05). There were 18.8% higher trypsin, 36.8% higher amylase, and 19.8% higher lipase activities in the intestines in the grass carp juveniles fed the diets containing synbiotics than those in the juveniles in the control group. In the patopancreas, however,the fish fed the diets containing synbiotics had 14.6% higher trypsin, and 21.3% higher lipase activities than the animals in the control group did(P<0.05), without significant difference in amylase activity.
Key words：Ctenopharyngodonidella; synbiotics;Bacilluslicheniformis; xylo-oligosaccharide; weight gain rate; intestinal microflora; digestive enzyme activity
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.02.007
文章编号：2095-1388(2014)02-0136-05
收稿日期：2013-07-14
基金项目：国家大宗淡水鱼类产业技术体系(CARS-46-43,CARS-46-20)
中图分类号：S963
文献标志码：：A