摘要：以鲣鱼脑为原料，对鱼脑磷脂超声提取方法进行了研究。以磷脂提取率为评价指标，通过单因素和正交试验优化了鱼脑磷脂提取的条件。结果表明：以正己烷-乙醇(体积比2∶1)为提取溶剂，超声提取时间为40 min，超声温度为35 ℃，固液比为1∶9(g∶mL)，超声提取2次，在此条件下鱼脑磷脂的提取率达到氯仿-甲醇法的87.1%;通过薄层色谱分析，确定鲣鱼脑磷脂中含有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂3种磷脂;用气相色谱法测定鲣鱼脑磷脂的脂肪酸组成，高不饱和脂肪酸中DHA和EPA的含量分别为21.1%和2.4%。研究表明，用超声法提取鱼脑磷脂具有可行性，鱼脑磷脂中含丰富的不饱和脂肪酸，在食品加工中具有一定的应用前景。
关键词：鱼脑；磷脂；超声波；脂肪酸
鲣是金枪鱼的一种，也是金枪鱼类资源最丰富的鱼种，年渔获量几乎占全世界金枪鱼类渔获量的50%，约150万t[1]。鲣主要被加工成罐头，在其加工过程中，产生的副产物大约占体质量的50%～70%[2]，鱼头占副产物的比例较大，鱼脑作为鱼头的一部分，除含有蛋白质外，还含有丰富的磷脂，是可利用的磷脂资源。磷脂是含磷酸基团的类脂化合物，主要存在于植物种子以及动物的脑、肝、卵中，是细胞膜结构的主要组成部分，具有调节膜酶活性、改善脂质代谢等生理功能[3-4]。磷脂还具有乳化作用，已被广泛应用于食品、药品、皮革加工等行业[5]。本研究中，对超声波辅助提取鱼脑磷脂的提取效率进行了研究，以期为鱼产品加工副产物中鱼脑的高值化利用提供科学依据。
1.1材料
试验用鲣鱼脑取自山东靖海实业有限公司水产品加工厂。
磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、神经鞘磷脂(SM)、溶血卵磷脂(LPC)标准品，均购于美国Sigma 公司；硅胶GF254薄层层析板(10×20 cm)，购于青岛海洋化工公司；乙醇、正己烷等其他试剂均为分析纯。
仪器有超声波发生器(KJ-600)、气相色谱仪(GC-2010)、紫外可见光分光光度计(721型)。
1.2方法
1.2.1 超声法提取磷脂的试验流程 鱼脑解冻破碎→正己烷-乙醇超声提取→ 抽滤→磷脂萃取液→浓缩→冷丙酮提纯→沉淀(磷脂)。
1.2.2 超声法提取鱼脑磷脂的试验设计 在恒定功率300 W下，采用正己烷-乙醇混合溶剂提取鱼脑中的磷脂。以溶剂混合比、固液比、超声时间、超声温度和超声提取次数作为影响因素进行单因素试验，然后进行正交试验优化磷脂提取工艺条件。
1.2.3 氯仿-甲醇法提取磷脂 参照文献[6]中的方法，用氯仿-甲醇法提取鱼脑磷脂，因磷脂不溶于丙酮，故对提取的鱼脑总脂肪用丙酮洗涤，获取的不溶物即为粗磷脂。试验步骤为：鱼脑经解冻匀浆后称取10 g，在氯仿-甲醇溶剂中萃取，收集下层氯仿层，于38 ℃下真空浓缩后的样液，经冷丙酮反复洗涤至无色，收集沉淀即为磷脂样品。
1.2.4 磷脂含量的测定和相对提取率的计算 参照GB/T 5537—2008《粮油检验：磷脂含量的测定》中的方法进行分析测定。
相对提取率(K)的计算公式为
1.2.5 磷脂的定性分析 用氯仿溶解磷脂标准品配成1 mg/mL溶液，将标准品与样品点于同一硅胶GF254薄层层析板上，在层析液(φ(氯仿)∶φ(甲醇)∶φ(水)=65∶25∶4)中展开，展距10 cm，用碘蒸气显色，通过比较样品与标准品的比移值(Rf)，来确定样品中磷脂的组成成分。
1.2.6 脂肪酸分析 制取的鱼脑磷脂采用三氟化硼法甲酯化[7]后，参照《GB/T 17377—2008 动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析》中的方法进行气相色谱分析。
2.1用超声法提取鲣鱼脑磷脂条件的单因素试验
2.1.1 提取溶剂 一般非极性溶剂适合于溶解游离态的脂类，对结合态的脂类提取效率不高。天然产物中磷脂常与蛋白结合[8]，为此，本试验中选用混合溶剂进行提取，其优势在于极性溶剂乙醇的加入可以破坏磷脂和蛋白质的结合，提高磷脂的得率。在提取温度为35 ℃、超声提取时间为30 min、固液比(均为g∶mL)为1∶5、超声辅助提取一次的条件下，正己烷与乙醇的不同配比对磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见，磷脂的提取率随着正己烷与乙醇配比的改变呈先升高后降低的趋势，当正己烷与乙醇溶剂的体积比为3∶1、2∶1、1∶1时，相对提取率分别为35.5%、51.6%和32.2%。因此，本试验条件下，选用正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1时，磷脂提取效果最好。
2.1.2 提取时间 在正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、温度为35 ℃、提取时间为30 min、固液比为1∶5、超声波辅助提取一次的条件下，不同提取时间对磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见，磷脂相对提取率随着提取时间的延长逐渐升高，而当提取时间为40～70 min时，相对提取率的增加趋势变缓。因此，在本试验条件下，提取时间选择40 min时，磷脂提取效果较好。
2.1.3 固液比 在正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、温度为35 ℃、超声时间为40 min、超声提取一次的条件下，不同固液比对磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见：磷脂相对提取率随着固液比的增大呈上升趋势。当固液比为1∶9时，相对提取率达到74.1%；当固液比增大到1∶11时，提取率变化不大。因此，本试验条件下，选择固液比为1∶9时，既能节约溶剂又能保证磷脂提取效果。
图1 正己烷与乙醇的配比、超声提取时间、固液比、温度、超声提取次数对磷脂提取率的影响
Fig.1 Effect of n-hexane/ethanol ratio，ultrasonic extractive time，solid-liquid ratio，temperature，and ultrasonic frequency on the extraction rate of the phospholipids
2.1.4 温度 在正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、超声时间为40 min、固液比为1∶9、超声提取一次的条件下，不同温度对磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见，温度为15～35 ℃时，磷脂的相对提取率随温度的升高逐渐增加，由48.4%增加到78.1%，当温度继续升高时，磷脂的相对提取率却逐渐下降。有研究表明，温度升高使分子动能增加，从而提高萃取效率，但温度过高时又会使卵磷脂氧化降解，磷脂含量降低[8]。因此，本试验条件下，选择温度为35 ℃时磷脂提取效果最好。
2.1.5 超声提取次数 在正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、超声时间为40 min、固液比为1∶9、温度为35 ℃的条件下，超声提取次数对鱼脑磷脂提取率的影响如图1所示。从图1可见，磷脂提取率随超声提取次数的增加而增加，但超声提取3次与2次相比，磷脂提取率的变化不大。因此，本试验条件下，选择超声提取次数为2时，磷脂提取效果较好。
2.2超声提取法的正交试验设计
根据单因素试验结果，选择在恒定功率为300 W，超声提取2次的条件下，以混合溶剂配比、超声提取时间、固液比和温度为因素，以磷脂相对提取率为指标，按L9(34)进行正交试验设计，因素水平表如表1所示。
表1因素水平表
Tab.1Thetableoffactorsandlevels
水平level因素factorA提取时间/minextractivetimeB溶剂配比solventratioC固液比(g∶mL)solid-liquidratioD温度/℃temperature1203∶11∶7252302∶11∶9303401∶11∶1135
表2磷脂提取正交试验设计方案与结果
Tab.2Resultsandanalysisintheorthogonalexperimentofphospholipids
试验号No ABCD相对提取率/%relativeextractionrate1111158 32122275 53133359 34212380 55223178 96231263 57313280 78321382 99332169 7k164 473 268 269 0k274 379 175 273 2k377 864 273 074 2R13 414 97 05 3
由极差分析结果表明：用超声法提取鱼脑磷脂的过程中，溶剂配比对磷脂的提取率影响最大，各因素对提取效果的影响程度依次为溶剂配比、提取时间、固液比、提取温度，最佳试验组合为A3B2C2D3，即当超声功率为300 W、正己烷与乙醇的溶剂比为2∶1、超声提取时间为40 min、固液比为1∶9、温度为35 ℃、超声提取2次的最优工艺条件下，磷脂的提取率最高。在此最优工艺条件下进行验证试验，可从每克鱼脑中(湿质量)中提取得到19.59 mg磷脂，与氯仿-甲醇法(22.49 mg)相比，磷脂的相对提取率达到87.1%。由于氯仿、甲醇的毒性较高，具有损伤眼膜和致癌的作用，而本试验中选用正己烷与乙醇，在保证一定提取效率的前提下，又相对降低了溶剂的毒性，是较为安全有效的磷脂提取方法，可以替代氯仿-甲醇法提取磷脂。
2.3鲣鱼脑磷脂的组分分析
从超声提取的鲣鱼脑磷脂与磷脂标准品的薄层色谱图(图2)可知，鲣鱼脑中含有4种磷脂成分，对照比移值可知其中3种为PE、PC、SM，第四点(X)未能确定其成分，依据文献[9]报道，推测X点可能为磷脂酰甘油(PG)。此外PE、PC所对应的斑点面积较大，分析其中PE和PC含量相对较高。
注：1 磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰胆碱(PC)；2 神经鞘磷脂(SM)；3 溶血卵磷脂(LPC)；4 鲣鱼脑磷脂
Note:1，phosphatidyl ethanolamine,and phosphatidylcholine;2,sphingomyelin;3,lysophosphatidylcholine;4,phospholipids of the skipjack brain
图2 鲣鱼脑磷脂薄层色谱图
Fig.2 Thin-layer chromatogram of phospholipids extracted from Skipjack brain
2.4鲣鱼脑磷脂的脂肪酸组成分析
通过气相色谱分析了鲣鱼脑中磷脂的脂肪酸组成。从表3可见：鲣鱼脑中磷脂的脂肪酸主要由C16∶0、C18∶0、C18∶1n9c、C20∶5n3、C22∶6n3构成，且DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)含量分别为21.1%和2.4%，说明鲣鱼脑中有较高含量的富含DHA、EPA的磷脂存在。而大豆和蛋黄磷脂的脂肪酸主要由C16∶0、C18∶1、C18∶2构成，不含DHA和EPA[10]。有研究表明，海参磷脂的不饱和度远大于大豆磷脂，对小白鼠增强脂肪代谢和控制糖代谢方面的效果也优于大豆磷脂，可以明显抑制小白鼠体质量的增长[11]。所以，鱼脑磷脂的利用价值应高于目前一般使用的大豆和蛋黄磷脂。
表3鲣鱼脑磷脂的脂肪酸组成
Tab.3Thefattyacidcompositionofphospholipidsfromskipjackbrain
脂肪酸fattyacid含量content/%C16∶014 1C18∶012 3C18∶1n9c23 0C18∶2n6c0 4C20∶5n32 4C22∶6n321 1其他26 7EPA+DHA23 5
超声波辅助提取是一个物理提取过程，其优点在于此过程中无化学反应发生，提取物的生物活性相对稳定[12]。本试验中将超声技术应用于鲣鱼脑磷脂的提取，结果表明，该法提取磷脂具有可行性。通过薄层色谱分析，确定鲣鱼脑中含有PE、PC、SM，还可能含有PG。
目前，国内外对大豆和蛋黄磷脂的研究居多，对海洋磷脂的研究相对较少。比较鲣鱼脑磷脂、大豆和蛋黄磷脂的脂肪酸组成，发现鲣鱼脑磷脂中含有更丰富的DHA和EPA，可能比大豆磷脂和蛋黄磷脂具有更丰富的生物活性。用超声法提取鲣鱼脑磷脂的研究，既为有效地利用鲣鱼头资源提供科学依据，也为海洋磷脂的开发提供了新思路。
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Abstract：In this study, the extraction of phospholipids from skipjack brain was studied by ultrasonic method, and optimized by a single factor experiment and orthogonal experiment. The optimal conditions or extraction yield of phospholipids were obtained as the following conditions of the ratio of hexane and ethanol=2∶1, 40 min,35 ℃, the ratio of material to solvent=1∶9, and ultrasonic method for twice, with the phospholipids extraction efficiency of 87.1% relative to the chloroform-methanol method. The thin-layer chromatography(TLC)revealed that the phospholipids contained phosphatidylethanolamine(PE), phosphatidylcholine (PC),and sphingomyelin (SM). The gas chromatography analysis showed that there were high unsaturated fatty acids including 21.1% of DHA and 2.4% EPA in the phospholipid fatty acids of skipjack brain. The findings indicate that it is feasible to extract phospholipids from the fish brain by ultrasonic method, and that there is rich in unsaturated fatty acids in the phospholipids of the skipjack brain，showing some potential for development in food processing.
Key words：fish brain; phospholipid; ultrasonic wave; fatty acid
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.01.014
文章编号：2095-1388(2014)01-0066-04
收稿日期：2013-03-27
基金项目：辽宁省教育厅科学研究项目(L2012257)
中图分类号：TS254.5
文献标志码：：A