图1 絮凝时间、絮凝剂添加量、小球藻浓度对采收率的影响
Fig.1 Effects of flocculation time， flocculant dosage，and Chlorella vulgaris concentration on recovery ratio
摘要：以氢氧化钙为絮凝剂，对海水小球藻Chlorellavulgaris絮凝工艺效果进行了试验研究。单因素试验结果表明，当絮凝时间为60～80 min、氢氧化钙添加量为0.6～0.8 g/L和藻液pH为8～10时，最有利于小球藻的采收。在单因素试验的基础上，利用响应面法对小球藻的絮凝条件进行了优化，建立了二次回归模型。通过分析得出：各因素对小球藻采收率均有极显著性影响(P<0.01)，影响次序为氢氧化钙添加量>絮凝时间>藻液pH；絮凝时间与藻液pH以及氢氧化钙添加量与藻液pH的交互作用对小球藻采收率均有极显著性影响(P<0.01)。利用回归方程预测小球藻的最佳絮凝条件，当絮凝时间为77 min、氢氧化钙添加量为0.7 g/L、小球藻液pH为9.3时，小球藻的采收率可达93.9%。
关键词：小球藻；氢氧化钙；絮凝沉降；采收；响应面分析法
近年来，微藻作为一种重要的食品、化工和可再生能源的原料，备受人们关注[1-4]。但迄今为止，微藻的浓缩采收一直未能实现规模化生产，其原因是微藻细胞小、浓度低，采收成本过高[5-6]。目前，生产过程中常用的采收方法有离心分离法、过滤法、泡载分离法、絮凝沉淀法和气浮分离法等[7-8]，其中絮凝沉淀法具有操作简单、设备投资少等优点，常与其他方法一起配合使用[9-10]，但絮凝剂的选择很关键。张亚杰等[11]开展了聚合氯化铝(PAC)、聚合硅酸硫酸铝(PASS)和聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDADMA)絮凝小球藻的研究，并对其实际应用的经济性进行了评价，得出最低浓缩成本约为589元/t；Divakaran等[12]研究发现，壳聚糖对于小球藻具有较好的絮凝效果；张国权等[13]利用壳聚糖絮凝小球藻，降低了现行的采收成本，为生产食用级的微藻产品提供了依据；岳伟萍等[14]利用氢氧化钠对海链藻Thalassiosiranordenskioldi进行絮凝试验发现，当氢氧化钠的质量浓度为0.05 g/L时，细胞的采收率可达85%；吕乐等[15]发现，纳米铁具有高效沉降蓝藻的效果，当pH为5时，10 min内可以絮凝沉降89.6%以上的水华蓝藻Cyanbacteria细胞。
氢氧化钙是一种廉价易得的絮凝剂，电离产生游离Ca2+及各种带正电荷的水解产物，小球藻表面的多羟基有机酸或糖类发生离解，从而使藻细胞表面带有一定量的负电荷，两者通过吸附或者电中和聚团沉降[16-18]，而加入的氢氧化钙可以在培养微藻过程中用CO2去除，因此，氢氧化钙絮凝微藻具有一定的优势。但由于氢氧化钙的水溶性较低，且容易受藻液体系的pH、盐度等因素的影响，过多的添加量不仅达不到微藻采收的要求，且容易造成水体污染和成本浪费。薛蓉等[19]对比了硫酸铁、硫酸铝、三氯化铁和氢氧化钙对小球藻的絮凝效果，发现用氢氧化钙作为絮凝剂，成本最低，且上层清液可以继续用于培养小球藻，但是并未对絮凝条件进行优化。本研究中，选用氢氧化钙作为絮凝剂，在单因素试验的基础上，利用响应面分析法[20]对小球藻的絮凝条件进行优化。
1.1材料
小球藻Chlorellavulgaris购自大连汇新钛设备开发有限公司，氢氧化钙(分析纯)购自天津博迪化工股份有限公司。
试验用仪器主要有BSA124S型电子天平、UV-7504紫外可见分光光度计、雷磁pH-2F型pH计、CX41型生物显微镜。
1.2方法
试验用小球藻原藻液的pH为8.24，细胞密度为8.03×107个/mL，在680 nm波长下的吸光度值(OD680 nm)为0.921。
1.2.1 测定方法
(1)小球藻的细胞浓度。测定藻液在680 nm波长下吸光度值，用以间接表示小球藻生物量的变化，记为OD680 nm[21]。
(2)小球藻的采收率。取100 mL藻液，加入不同量的氢氧化钙，利用磁力搅拌器搅拌3 min，待均匀后静置，用注射器缓慢抽取液面下4 cm处的藻液，测定OD680 nm，根据下式计算微藻的采收率：
采收率=(OD0-ODt)/OD0×100%。
(1)
其中：OD0为初始时刻藻液的OD680 nm；ODt为絮凝时间t时藻液的OD680 nm。
1.2.2 单因素试验设计
(1)絮凝时间对采收率的影响试验。取100 mL藻液，按0.1、0.3、0.8、1.6 g/L加入氢氧化钙，利用HJ-3型恒温磁力搅拌器搅拌3 min后絮凝，每隔20 min用注射器分别缓慢抽取各组液面下4 cm处的藻液，测定OD680 nm，每次取3个平行样求平均值，并计算采收率。
(2)絮凝剂添加量对采收率的影响试验。取100 mL藻液，按 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、1.8、2.0 g/L加入氢氧化钙，固定絮凝时间，测定OD680 nm，每次取3个平行样求平均值，并计算采收率。
(3)藻液浓度对采收率的影响试验。取100 mL原藻液，用蒸馏水分别稀释为原来的2、4、6、8、10倍，固定絮凝时间和氢氧化钙添加量，测定OD680 nm，每次取3个平行样求平均值，并计算采收率。
(4)藻液pH对采收率的影响试验。利用1 mol/L盐酸和1 mol/L NaOH调节藻液pH为8～12，加入固定量的氢氧化钙，絮凝一定时间，观察不同藻液pH对絮凝效果的影响。
1.2.3 响应面法优化试验设计 以单因素试验为基础，根据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，选取对小球藻采收率影响显著的因素，以3次平行试验所得的小球藻采收率的平均值作为响应值(Y)，通过Design Expert 8.0.5软件进行响应面分析，在此基础上得出各因素之间的最佳组合。
2.1单因素试验
2.1.1 絮凝时间对絮凝效果的影响 从图1可见：絮凝剂添加量为0.3、0.8、1.6 g/L时，小球藻的采收率随絮凝时间的增加而增大，前60 min增加趋势明显，60 min时采收率分别达到29.8%、80.5%和85.3%，之后，絮凝趋于稳定；当絮凝剂添加量为0.1 g/L时，絮凝效果不明显，采收率小于3.5%。絮凝时间相同时，采收率随着絮凝剂添加量的增加而增大，絮凝时间为80 min时，4个絮凝剂添加量下小球藻的采收率分别为3.2%、30.3%、84.3%、89.4%。一般来说，絮凝时间越长，絮凝剂与藻细胞之间、藻细胞相互之间接触越充分，结团沉降就越完全，采收率也越高。薛蓉等[19]研究发现，利用氢氧化钙絮凝小球藻90 min时，采收率在90%左右，但是如果絮凝时间过长，生产周期延长，细胞的活性也可能会发生改变。因此，考虑生产周期成本以及藻体的质量，在本试验条件下，絮凝时间为60～80 min时，絮凝效果较好。
2.1.2 絮凝剂添加量对絮凝效果的影响 从图1可见：随着絮凝剂添加量的增加，小球藻采收率随之增高；当絮凝剂添加量为0.6 g/L时，小球藻絮凝效果骤增，采收率达到80.7%；絮凝剂添加量再增加时，采收率增加缓慢，当絮凝剂添加量从0.6 g/L增加到1.4 g/L，采收率仅从80.7%增加到92.2%。这是由于絮凝剂添加量增加， 藻体与絮凝剂之间的碰撞几率增大，絮凝效果显著，特别是当絮凝剂添加量增加到使藻液体系正负电荷中和的时候，絮凝效果最好，可获得较高的采收率。继续增加絮凝剂添加量，其对絮凝效果的影响减弱。因此，考虑到成本问题及后续生产的要求，在本试验条件下，絮凝剂添加量为0.6～0.8 g/L时，絮凝效果较好。
2.1.3 小球藻浓度对采收率的影响 从图1可见：随着藻液浓度的降低，采收率随之降低；当稀释倍数为8倍时，采收率达84.5%，但当稀释倍数从8倍增加到10倍时，采收率从84.5%急剧降到58.9%。可见，对于低浓度藻液，絮凝剂与藻细胞、藻细胞之间碰撞结团的几率相对减少，采收率随之降低。继续稀释时，体系中藻细胞数量较少，所带的负电荷不足以中和絮凝剂电离产生的阳离子所带的正电荷，从而产生一定的排斥作用，致使采收率下降较明显。因此，在本试验条件下，稀释倍数为2～8倍时，絮凝效果较好。
图1 絮凝时间、絮凝剂添加量、小球藻浓度对采收率的影响
Fig.1 Effects of flocculation time， flocculant dosage，and Chlorella vulgaris concentration on recovery ratio
2.1.4 藻液pH对絮凝效果的影响 从表1可见：随着藻液pH的增加，小球藻采收率下降，当藻液pH由8升至10时，采收率由95.7%降至85.3%。这是由于随着pH的增加，氢氧化钙的溶解性降低，电离产生的阳离子数量减少的缘故。倘若降低藻液pH，虽然有利于小球藻的采收，但对于其细胞的正常生长可能会产生影响，既不利于小球藻的循环培养，又会造成水体污染，从而增加了处理成本。当藻液pH为11～12时，产生的絮凝物过于分散，达不到采收要求，且沉淀的小球藻颜色部分发白，这可能是由于过高的碱性使得藻细胞大量失水而失去活性。因此，在本试验条件下，小球藻藻液的pH为8～10时，絮凝效果较好。
2.2响应面法优化絮凝条件
絮凝时间、絮凝剂添加量和藻液pH试验3个因素的水平见表2，试验设计及试验结果见表3。
表1小球藻藻液pH对采收率的影响
Tab.1EffectsofpHinthealgafluidonrecoveryratio
pH 絮凝效果 flocculationeffect采收率/%recoveryratio8絮凝速度快，沉淀密实，主要集中在烧杯8cm刻度以下95 79絮凝速度较快，沉淀密实，主要集中在烧杯10cm刻度以下93 610絮凝速度较快，沉淀密实，沉淀物部分发白，主要集中在烧杯10cm刻度以下85 311絮凝较慢，沉淀疏松，沉淀物发白，分散在烧杯50cm刻度范围内-12絮凝较慢，沉淀疏松分散，沉淀物发白，分散在烧杯50cm刻度范围内-
表2响应面试验因素水平表
Tab.2Factorsandlevelsinaresponsesurfaceanalysis(RSA)test
水平level因素factorA时间/mintimeB絮凝剂添加量/(g·L-1)flocculationusageCpH-1016070800 60 70 88910
表3响应面试验设计及试验结果
Tab.3DesignandresultsofRSAtest
试验号No ABC采收率recoveryratio/%100092 0200092 53-10183 2400092 0510-186 76-1-1078 9701189 3800092 4901-184 61010190 611-10-184 412-11085 9130-1-179 41411091 31500091 7160-1179 9171-1083 0
运用Design Expert 8.0.5 软件对采收率试验结果进行回归分析，得到二次回归模型为
Y=92.12+2.40625A+3.74875B+0.9925C+
0.3525AB+1.28AC+1.045BC-
(2)
2.21625A2-5.13125B2-3.70375C2，
R2=0.9968。
对模型(2)中各因素进行方差分析。从表4可见：絮凝时间、絮凝剂添加量和藻液pH对采收率均有极显著性影响(P<0.01)，其中絮凝剂添加量的影响最显著，其次是絮凝时间和藻液pH；絮凝时间与藻液pH的交互作用以及絮凝剂添加量与藻液pH的交互作用对采收率均有极显著性影响(P<0.01)，且前者要大于后者，而絮凝时间与絮凝剂添加量的交互作用对采收率的影响不显著(P>0.05)；回归方程也具有极显著性(P<0.01)，即絮凝时间、絮凝剂添加量和藻液pH对采收率影响均极显著。
表4采收率回归方程的方差分析
Tab.4ANOVAanalysisofrecoveryratioregression
方差来源sources平方和sumofsquares自由度degreeoffreedom均方meansquareF值FvalueP模型model386 62942 96243 550<0 0001∗∗A46 32146 32262 615<0 0001∗∗B112 431112 43637 395<0 0001∗∗C7 8817 8844 6800 0003∗∗AB0 5010 502 8200 1371AC6 5516 5537 1600 0005∗∗BC4 3714 3724 7660 0016∗∗A220 68120 68117 256<0 0001∗∗B2110 861110 86628 536<0 0001∗∗C257 76157 76327 470<0 0001∗∗残差residualerror1 2370 18失拟项lackoffit0 8530 282 9100 1646纯误差pureerror0 38840 10总和totalerror387 8516
注： *表示有显著性差异(P<0.05);**表示有极显著性差异(P<0.01)
Note: * shows significant (P< 0.05); ** denotes very significant (P< 0.01)
响应曲面和等高线如图2～图4所示。从图2可见，曲面中的最高点在絮凝时间和絮凝剂添加量均达到最大时得到，和单因素试验结果一致，说明絮凝时间和絮凝剂添加量的交互作用对采收率的影响较低。从图2～图4可见：絮凝时间与藻液pH的交互作用对采收率的影响最显著；絮凝剂添加量对采收率的显著性影响要高于絮凝时间，絮凝时间和絮凝剂添加量对采收率的显著性影响均高于藻液pH，3个因素对采收率的显著性影响依次为絮凝剂添加量>絮凝时间>藻液pH。响应面法分析结果与方差分析结果一致。
图2 Y=f(A,B)的响应面
Fig.2 Responsive surface plot Y=f(A,B)
图3 Y=f(A,C)的响应面
Fig.3 Responsive surface plot Y=f(A,C)
图4 Y=f(B,C)的响应面
Fig.4 Responsive surface plot Y=f(B,C)
综上所述，利用氢氧化钙絮凝采收小球藻时，3个因素中絮凝剂添加量对小球藻采收率的影响最显著，因此，首先要控制絮凝剂的添加量；同时，考虑到3个交互作用中絮凝时间与藻液pH的交互作用对采收率的影响最显著，合理控制絮凝时间与藻液pH的交互作用，均可提高小球藻的采收率。
(1)单因素试验结果表明，当絮凝时间为60～80 min、氢氧化钙添加量为0.6～0.8 g/L和藻液的pH为8～10时，最有利于小球藻的采收。
(2)三因素三水平的响应面试验结果表明，各因素对小球藻采收率均有极显著性影响，依次为絮凝剂添加量>絮凝时间>藻液pH，絮凝时间与藻液pH以及絮凝剂添加量与藻液pH的交互作用对小球藻采收率均有极显著性影响。絮凝时间、絮凝剂添加量和藻液pH对小球藻采收率的影响可用二次回归模型来描述。通过响应面法优化得出，当絮凝时间为77 min、絮凝剂添加量为0.7 g/L和藻液pH为9.3时，小球藻采收效果最好，采收率为93.9%。
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Abstract：Flocculation experiments of green algaChlorellavulgarisby calcium hydroxide were carried out. Results of single-parameter experiments showed that higher recovery ofChlorellavulgariswas achieved when the flocculation time, the dosage of calcium hydroxide, and the pH of culture fluid were kept at 60-80 min, 0.6-0.8 g/L, and 8-10, respectively. Additionally, a regression model regarding toChlorellavulgarisrecovery ratio was established by the response surface analysis(RSA) and based on the results of multi-parameter experiments. The optimum conditions forChlorellavulgarisflocculation were determined correspondingly. It was demonstrated that the influence of calcium hydroxide dosage onChlorellavulgarisrecovery was the most significant and followed were the flocculation time and the pH of algae fluid. It was also known that the interaction of flocculation time with pH, and calcium hydroxide dosage with pH were relatively significant to the recovery ofChlorellavulgaris. The recovery ratio ofChlorellavulgarisreached to 93.9% when the flocculation time, the dosages of calcium hydroxide, and the pH of culture fluid were maintained at 77 min, 0.7 g/L, and 9.3, respectively.
Key words：Chlorellavulgaris; calcium hydroxide; flocculation; recovery; response surface analysis(RSA)
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.01.013
文章编号：2095-1388(2014)01-0061-05
收稿日期：2013-07-01
基金项目：辽宁省优秀人才支持计划项目(LR2011020)
中图分类号：TE667
文献标志码：：A