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组别group水分moisture干物质drymatter粗灰分crudeash粗蛋白crudeprotein粗脂肪crudelipid饲料147 30552 69512 04224 9667 86饲料25 66294 33813 84559 77823 38
摘要：在水温为23 ℃条件下，将体质量为(2.78±0.09)g的刀鲚Coilianasus幼鱼饲养在室内水泥池循环水系统中，分别投喂人工配合饲料1(缓沉软颗粒料)和饲料2(缓沉硬颗粒料)。饲养60 d后，分析两组刀鲚幼鱼的形体指标、消化酶和脂质代谢酶活性的差异；并采用H.E染色法从肝、胃、肠组织等方面比较了两组刀鲚幼鱼消化系统的组织结构差异。试验结果表明：两组刀鲚幼鱼的增重率分别为76.64%和104.17%，且组间有显著性差异(P<0.05)；两组幼鱼的肥满度、特定生长率有显著性差异(P<0.05)，两组幼鱼的肝体比和脏体比以及胃淀粉酶、胃蛋白酶、肝脏脂肪酶活性均无显著性差异(P>0.05)。消化系统组织学观察表明：饲料2组幼鱼的肝脏细胞质中存在明亮的脂肪滴，饲料1组幼鱼胃壁上的皱褶多且较高；饲料2组幼鱼的前肠直径、黏膜褶高度和肌层厚度均比饲料1组高，表明两组幼鱼胃和肠的消化能力和对饲料的消化速度存在差异；结合食物消化动态过程，饲料2组幼鱼的消化吸收能力比饲料1组幼鱼强。研究表明，饲料2更适合刀鲚幼鱼生长，适合于刀鲚幼鱼驯养阶段使用。
关键词：刀鲚; 消化系统; 人工饲料; 组织学
鱼类消化系统具有摄取、转运、消化食物，以及吸收营养、排泄废物等生理功能，在新陈代谢过程中发挥着重要作用。为了确定人工养殖过程中合理、高效的饲料配方，一些学者开展了鱼类消化系统的组织学特征研究[1-3]，其中，关于食性和饵料对鱼类消化系统形态学和组织学影响的研究较多[4-7]。
刀鲚Coilianasus隶属于鲱形目、鳀科、鲚属，又名长颌鲚，俗称刀鱼，为中国长江中重要的洄游性鱼类[8]。因其丰腴肥满、肉鲜味美、营养丰富，享有“长江三鲜”之一的美誉。自然条件下，刀鲚幼鱼主要以枝角类、桡足类等浮游动物为食，成鱼以小鱼、小虾为食[9-10]；池塘养殖条件下，刀鲚在不同发育阶段的摄食量与饵料生物的种类和数量密切相关[11]。随着刀鲚人工繁育和用配合饲料对其驯养的成功，对刀鲚养殖用配合饲料的营养成分、物理性状等研究也有序展开。但有关刀鲚人工养殖中配合饲料的选择及其对刀鲚消化系统和功能影响的研究目前尚未见报道。本研究中，采用成功驯养刀鲚所使用的两种配合饲料投喂刀鲚幼鱼后，分析刀鲚幼鱼消化系统的形态、组织结构的变化，以此对饲料进行比较，旨在为刀鲚配合饲料的开发提供参考。
1.1材料
于2012年9月在长江靖江段捕捞长江刀鲚幼鱼，驯养于室内水泥池(700 cm×435 cm×120 cm)中。
1.2方法
1.2.1 试验设计 试验前驯化养殖20 d，测得刀鲚幼鱼的体质量为(2.78±0.09)g，体长为(9.50±0.51)cm。试验时将试验鱼随机分配到6个水泥池中，每池放养500尾，分为2组，每组设3个平行。每天8:00、14:00投喂，采用饱食法投喂，将饵料分几次投入，每次投入均被摄食完，一直到刀鲚无摄食反应、不来抢食才停止投喂。试验期间，平均水温约23 ℃，溶氧≥6.0 mg/L，盐度为0.45～0.60。饲养试验共进行60 d。
1.2.2 人工饲料的配制 选取两种常见的饲料进行驯养试验，其中，饲料1为配合饲料干粉料，购自宁波天邦有限公司，按粉状饲料与水分的质量比为3∶2均匀混合后再经16目筛网过滤，制成缓沉软颗粒饲料，粒径为1.3～1.6 mm；饲料2为配合饲料缓沉硬颗粒料，粒径为1.6 mm，购自山东升索渔用饲料研究中心。两种配合饲料的主要成分均为鱼粉、虾粉、大豆、小麦粉、维生素、钙、磷等。两种饲料的主要营养成分(均为质量分数)如表1所示。
表1两种饲料的基本营养水平
Tab.1Basalnutritionlevelsoftwoformulateddiets
%
组别group水分moisture干物质drymatter粗灰分crudeash粗蛋白crudeprotein粗脂肪crudelipid饲料147 30552 69512 04224 9667 86饲料25 66294 33813 84559 77823 38
1.2.3 各项指标的测定与计算 饲养60 d后进行采样，从每个池中随机取9尾鱼进行体质量、体长、内脏质量、肝脏质量等常规生物学数据的测量，并用于肥满度、脏体比、肝体比等指标的计算，各生长指标的计算公式参照文献[12]。
将胃、肝脏样本分别加入10倍的缓冲液(4 ℃)于冰浴下匀浆，制成体积分数为10%的匀浆液，并于4 ℃下以2000 r/min离心10 min，取上清液保存于冰箱(-20 ℃)中备用。采用考马斯亮蓝法测定组织上清液中蛋白质的含量；使用试剂盒(购自南京建成生物有限公司)测定胃上清液中的胃蛋白酶、淀粉酶活性，以及肝脏上清液中的脂肪酶活性；用CPT-I、CPT-Ⅱ和ACC定量检测试剂盒分别测定肝脏中肉碱软脂酰基转移酶-Ⅰ(CPT-Ⅰ)、肉碱软脂酰基转移酶-Ⅱ(CPT-Ⅱ)和乙酰CoA羧化酶(ACC)的含量，试剂盒均购自上海江莱生物技术有限公司。
试验结束后，从每个池中采集3尾幼鱼的胃、肠、肝样本，用Bouin’s液固定，48 h后将肠分为前、中、后肠，再用Bouin’s液固定48 h，进行清洗、脱水、二甲苯透明浸蜡和石蜡包埋，用Leica RM2235切片机连续切片，切片厚度为6 μm，再用H.E 染色、中性树胶封片，在光学显微镜下观察并拍照。
1.3数据处理
刀鲚的生长指标和酶活性指标数据均采用平均值±标准误表示。采用SPSS 11.7软件对数据进行处理，用LSD法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
2.1两种饲料对刀鲚幼鱼生长性能和相关酶活性的影响
从表2可见：两组刀鲚幼鱼的存活率都比较高，均在96%以上；饲料2组幼鱼的终末体质量、增重率、肥满度和特定生长率均显著高于饲料1组(P<0.05)；两组幼鱼的终末体长、存活率、肝体比和脏体比均无显著性差异(P>0.05)。
表2两种饲料对刀鲚幼鱼生长指数和形体指标的影响
Tab.2EffectofdifferentdietsongrowthperformanceandmorphologyofjuvenileestuarytapertailanchovyCoilianasus
组别group初始体质量/ginitialbodyweight终末体质量/gfinalbodyweight增重率/%weightgainrate终末体长/cmfinalbodylength肝体比/%hepatosomaticindex脏体比/%viserosomaticindex肥满度/%conditionfactor存活率/%survivalrate特定生长率/(%·d-1)SGR饲料12 78±0 094 91±0 32a76 64±11 69a10 58±0 281 55±0 237 26±0 610 39±0 01a96 7±1 40 91±0 12a饲料22 78±0 095 68±0 32b104 17±11 49b11 05±0 191 44±0 109 57±0 990 42±0 01b97 5±1 21 17±0 09b
注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同
Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters within the same column are not significant differences,et sequentia
从表3可见：两组刀鲚幼鱼胃里的淀粉酶和胃蛋白酶活性均无显著性差异(P>0.05)；饲料2组刀鲚幼鱼肝脏中的脂肪酶活性显著高于饲料1组(P<0.05)；饲料2组幼鱼肝脏中的CPT-Ⅰ含量显著低于饲料1组(P<0.05)，而两组的CPT-Ⅱ和ACC含量均无显著性差异(P>0.05)。
2.2两组刀鲚幼鱼肝脏的形态和组织学特征
刀鲚肝细胞的大小基本相似，形态却多种多样，有的呈椭圆，有的呈多角形或梭状。其细胞核较大且轮廓清晰，为单个或者两个，位于细胞中间或偏位(图1-A、C)。通过H.E染色观察可见，两组刀鲚幼鱼的肝组织之间无明显差异，但饲料2组刀鲚幼鱼的肝脏细胞质中清晰可见明亮的脂肪滴存在，细胞质被脂肪挤压，多呈斑块状或围绕在细胞核外呈薄层状(图1-A、B)。
表3两种饲料对刀鲚幼鱼消化酶和脂肪代谢酶等的影响
Tab.3EffectofdifferentdietsonactivitiesofthedigestiveenzymesandfatmetabolismenzymesinjuvenileestuarytapertailanchovyCoilianasus
组别group淀粉酶/(U·mg-1)amylase胃蛋白酶/(U·mg-1)pepsin脂肪酶/(U·g-1)lipaseCPT-Ⅰ/(pg·mL-1)CPT-Ⅱ/(pg·mL-1)ACC/(U·mL-1)饲料10 09±0 023 76±0 4014 84±3 46a96 34±1 78a145 71±1 2318 59±0 60饲料20 06±0 012 44±0 8631 06±13 16b90 01±2 19b145 20±1 5118 69±0 31
注：CPT为肉碱软脂酰基转移酶；ACC为乙酰CoA羧化酶
Note:CPT,carnitine palmitoyl transferase;ACC,acetyl coenzyme A carboxylase
2.3两组刀鲚幼鱼胃的形态和组织学特征
通过H.E染色观察可见，刀鲚幼鱼胃里的食物尚未完全消化，饲料2组刀鲚幼鱼的胃中饲料颗粒较小，且大小均匀，而饲料1组刀鲚幼鱼的胃中饲料颗粒较大，且呈现出整块未消化状态(图1-D、E)。饲料1组刀鲚幼鱼胃壁上的皱褶比饲料2组多，平均有5～7个较大的呈马鞍状的皱褶，且黏膜皱褶较高，而饲料2组却没有(图1-D、E)。
2.4两组刀鲚幼鱼肠道的形态和组织学特征
刀鲚肠道为一直筒型管状物，肠壁分为黏膜层、黏膜下层、肌肉层、浆膜层。样本固定时将其分为前肠、中肠和后肠。通过H.E染色观察，两组刀鲚幼鱼的肠道特征基本相似。肠壁黏膜层形成非常丰富的绒毛，绒毛呈毛发状，数目多，且有的有分支，呈细长爪状，伸向管腔，有的还包裹着食物残渣。两组刀鲚幼鱼前肠绒毛较多，绒毛基部还可清晰地看到消化酶分泌物。绒毛数量从前肠到后肠逐渐减少，高度也逐渐降低，这与消化吸收能力相关。前肠直径最大，后肠直径次之，中肠直径最小；前肠的黏膜褶最高，褶的数目最多且分布紧密、规则；中肠黏膜褶的高度较前肠稍低，褶的基部变宽(图1-F、G、H)，分布稀疏，数目减少。
注：A 饲料2组刀鲚幼鱼肝脏(黑色箭头示细胞核，白色箭头示脂肪，×100)；B 饲料2组刀鲚幼鱼肝脏(箭头示脂肪，×40)；C 饲料1组刀鲚幼鱼肝脏(箭头示细胞核，×40)；D 饲料1组刀鲚幼鱼胃体(中间部分为食物团，箭头示胃壁褶皱，×4)；E 饲料2组刀鲚幼鱼胃体(中间部分为食物团，箭头示胃壁褶皱，×4)；F饲料1组刀鲚幼鱼前肠的肠壁(黑色箭头示分泌物，白色箭头示黏膜褶皱，×40)；G、H 饲料1组刀鲚幼鱼中肠、后肠的肠壁(箭头示黏膜褶皱，×40)
Note:A,liver of juvenile C.nasus fed diet 2(the black arrow showing nucleus, and the white arrow showing fat，×100);B,liver of juvenile C.nasus fed diet 2(the arrow showing fat,×40);C,liver of juvenile C.nasus fed diet 1(the arrow showing nucleus,×40);D,fundic stomach of juvenile C.nasus fed diet 1(the middle is food item, and the arrow showing wrinkle stomach wall,×4);E,fundic stomach of juvenile C.nasus fed diet 2(the middle is food group,the arrow showing wrinkle stomach wall,×4);F,foregut of juvenile C.nasus fed diet 1(the black arrow showing secreta, and the white arrow showing mucous membranes,×40)；G，H,midgut, and hindgut of juvenile C.nasus fed diet 1(the arrow showing mucous membranes,×40)
图1 两组刀鲚幼鱼消化系统的组织形态学结构
Fig.1 Morphology and histology of the digestive system between two groups in the juvenile estuary tapertail anchovy Coilia nasus
此外，饲料2组刀鲚幼鱼的前肠直径、黏膜褶高度和肌层厚度比饲料1组略大，饲料1组刀鲚幼鱼的后肠直径比饲料2组略大，但均未达到显著性差异水平(P>0.05)(表4)。
表4两组刀鲚幼鱼前肠、中肠、后肠组织结构的比较
Tab.4Thehistologicalstructurecomparisonofforegut,midgutandhindgutinjuvenileCoilianasusbetweentwogroups
部位section组别group直径/mmdiameter黏膜褶高度/mmheightofmucosa肌层厚度/μmthicknessofmuscularcoat前肠饲料12 13±0 011 55±0 091 85±0 32foregut饲料22 48±0 171 62±0 412 96±1 15中肠饲料11 81±0 380 96±0 431 94±0 39midgut饲料21 65±0 141 00±0 281 94±0 39后肠饲料12 28±0 010 96±0 232 41±0 64hindgut饲料22 09±0 030 98±0 232 41±0 84
肝脏是机体最大的消化腺[13]，在鱼类的食物消化、营养吸收和机体代谢等过程中起着重要作用。研究表明，大部分肉食性鱼类肝脏与脂肪代谢有着不可分割的关系，体内肝脏脂肪的储存量对鱼类越冬和性腺发育具有十分重要的作用[14]。深入了解肝脏的生理结构和功能特点可以为刀鲚幼鱼机体代谢和营养吸收提供重要的形态学依据和基础资料。本研究中，从组织学角度对肝脏组织细胞进行了观察和比较，结果发现，60 d的试验中，两种饲料并没有对刀鲚幼鱼的肝脏组织细胞造成明显差异。但是，饲料1组刀鲚幼鱼的肝体比值比饲料2组略高，饲料2组刀鲚幼鱼的肥满度和肝脏中的脂肪酶含量均比饲料1组高，饲料2组刀鲚幼鱼的肝细胞质中清晰可见明亮的脂肪滴，这正好与饲料2组肝脏中脂肪酶含量高相吻合，说明饲料2组幼鱼摄取较多含高脂肪的营养物质，可能与饲料2中粗脂肪含量高有关。另外，饲料1组脂肪分解的限速酶CPT-I含量高于饲料2组，而脂肪合成限速酶ACC含量却低于饲料2组，说明饲料1组刀鲚幼鱼脂肪酶分解速度快，而合成速度慢，鱼体内没有过多的脂肪沉积，肥满度和特定生长率必然会低于饲料2组。本试验中形体指标结果正好表明这一点，这也与张媛媛等[12]的研究结果相一致。因此，在人工养殖过程中，要保证配合饲料中蛋白质和脂肪的含量，从而保证饲料营养的全面性。
鱼类胃的主要功能是消化食物中的蛋白质[15]。胃在消化食物时，胃壁运动，其黏膜层会形成皱褶，皱褶表面会形成很多U形的胃小凹，用于快速磨碎食物。潘黔生等[15]认为，胃黏膜表面结构和分泌能力是胃对食物消化吸收的关键因素，而黏膜表面结构，主要与褶皱的变化情况及上皮杯状细胞的多少等有关,其结构状况可间接反映鱼类的消化能力和食物消化的难易状况。本试验中，相同时间段采样，饲料1组刀鲚幼鱼胃里的皱褶较多，黏膜上皮的杯状细胞数量多，胃里的淀粉酶和胃蛋白酶活力指数高(表3)，且食物颗粒大小不均；相比之下，饲料2组刀鲚幼鱼胃里的皱褶较少，黏膜上皮的杯状细胞数量少，淀粉酶和胃蛋白酶活力指数低，食物颗粒大小均匀。这可能与两组刀鲚幼鱼的消化能力及所摄食饲料的组成成分有关。
从饲料成分上来看，饲料2组的蛋白含量和干物质含量都比饲料1组高，从理论上讲，同样的时间里饲料2组应该比饲料1组消化的慢，淀粉酶和胃蛋白酶活性应该高于饲料1组，但实际情况恰好相反。本试验结果表明，饲料2组刀鲚幼鱼的体质量、体长、增重率、内脏比、肥满度、特定生长率等均高于饲料1组，这说明并不是饲料1比饲料2难以消化，而是饲料2组刀鲚幼鱼的消化吸收能力比饲料1组强，这可能是饲料2的组成成分提高了刀鲚幼鱼的消化功能。
在多数硬骨鱼类中，前肠肠腔膨大，管径大，而且管壁肌肉层十分发达，这将有助于食物在肠道中的推进[16-17]。前肠主要是吸收脂类物质的场所，在前肠黏膜的上皮细胞中有脂质吸收细胞，这被认为是类脂等物质的临时储存处[18]。肠壁上皮细胞胞质上方有分散存在的溶酶体，会产生很多有助于物质消化的酶类，可以把糖类、蛋白质、脂肪等分解成为可溶性小分子，这样有助于鱼类对物质的消化和吸收。
本试验中，饲料2组刀鲚幼鱼的前肠直径、黏膜褶高度和肌层厚度均比饲料1组的高，这可间接反映鱼类消化、吸收的能力。这种现象可能是两种因素造成的：一是鱼类前肠消化能力的改善，二是食物的组成成分[19]。从饲料2的基本营养组成来看，粗脂肪和粗蛋白等含量都比饲料1组高，说明饲料2组刀鲚幼鱼前肠的消化能力在饲料2的作用下有所改变，呈增强趋势。这为用饲料营养成分改善鱼类消化道结构的进一步研究提供了参考。本试验中，饲料1组刀鲚幼鱼的后肠直径比饲料2组大，说明饲料1组食物消化后的残渣剩余较多，需要排出的粪便较多。饲料2组刀鲚幼鱼的体质量、肥满度、特定生长率等都显著高于饲料1组，说明饲料1组刀鲚幼鱼对饲料1的消化吸收利用率明显比饲料2组低。
综上所述，从刀鲚幼鱼摄食两种配合饲料后的生长数据及消化系统组织学变化结果看，幼鱼对饲料2的利用效率比饲料1高，摄食饲料2组幼鱼的生长较佳。另外，饲料的组成成分会在一定程度上影响幼鱼消化系统的结构，在刀鲚幼鱼养殖初期可适当提高配合饲料中蛋白质和脂肪的含量，从而保证饲料营养的全面性，促进刀鲚幼鱼生长。
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Abstract：Effects of two formulated diets on growth and digestive enzymatic activity related to lipid metabolism, and digestive system histology were studied in estuarine tapertail anchovyCoilianasusjuveniles with body weight of (2.78±0.09)g fed two formulated diets (diet 1, dry powder, and diet 2, hard sinking pellet) at water temperature of 23 ℃ for 60 days. The results showed that the fish fed diet 1 had weight gain rate of 76.64% and the juveniles fed diet 2 had weight gain rate of 104.17%, with significant difference (P<0.05). There were significant differences in condition factor and specific growth rate (P<0.05), and no significant difference was observed in activities of amylase, pepsin, and lipase, hepatosomatic index and viserosomatic index in the fish fed the two diets(P>0.05).The histological observation revealed that the distinct oil droplets were found in the hepatic cells of the fish in diet 2 group. On the other hand, there were thicker and higher mucosal fold in gastric walls in the fish in diet 1 group than those in diet 2 group. The fish fed diet 2 showed higher foregut diameter, mucosal fold height and muscularis in the midgut in the fish fed the diet 2 than those in the fish fed the diet 1, indicating that the diet 2 is suitable for rearing estuarine tapertail anchovy juveniles.
Key words：Coilianasus; digestive system; artificial diet; histology
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.01.008
文章编号：2095-1388(2014)01-0035-05
收稿日期：2013-06-01
基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAD26B05，2012BAD25B07)；中央级公益性科研院所基本科研业务费院级专项(2013A0903)；公益性行业(农业)科研专项(201203065)；江苏省水产三新工程重大专项(DZ2012-1)
中图分类号：S917
文献标志码：：A