。摘要：在水温为(25±0.5)℃条件下，比较了不同pH(3.5～5.5, 8.5～10.5)时转红色荧光蛋白基因唐鱼Tanichthysalbonubes和野生型唐鱼受精卵的孵化率及其仔鱼在24、48、72、96 h的存活率，并测定了pH为4.5～9.5时两种初孵仔鱼的不投饵存活系数(SAI)。结果表明：野生型唐鱼孵化率略高于转基因唐鱼，二者孵化的适宜pH为5.0～8.5；转基因唐鱼仔鱼的96 h存活率略高于野生型唐鱼，而野生型唐鱼初孵仔鱼的SAI则高于转基因唐鱼。综合分析认为：两种仔鱼适宜生存的pH为5.0～9.0，各pH组间无显著性差异，说明两种类型的唐鱼对pH的耐受力没有明显差异。
关键词：转基因；唐鱼；pH；不投饵存活系数
唐鱼Tanichthysalbonubes隶属于鲤形目、鲤科、鱼丹亚科、唐鱼属，最早被发现于广州市白云山附近的溪流中，是一种小型的淡水观赏鱼类。珠江水产研究所农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室于2003年利用转基因技术成功筛选获得了一个可稳定遗传、体色红艳的转基因唐鱼新品系[1]。转基因唐鱼能否进入市场，实现商品化，需要评估其安全性，并获得转基因生物安全管理部门的批准。有研究表明，转基因唐鱼和野生唐鱼的生物学、抗逆性和生存竞争能力等无显著性差异[2-6]。
pH是影响鱼类生存的重要环境因子之一，pH过低或过高均能降低鱼类对低氧的耐受力[7]，直接影响鱼类的生长发育和生理状况[8]。本研究中，比较了不同pH条件下最为敏感的唐鱼早期发育阶段，转红色荧光蛋白基因唐鱼与野生型唐鱼的孵化率、初孵仔鱼活力和仔鱼耐受力，旨在了解转基因唐鱼是否存在生存优势，以及在自然水域是否对野生型唐鱼形成危胁。
1.1材料
试验鱼取自珠江水产研究所观赏鱼养殖基地。取性腺发育良好、体质健壮、无伤病的转基因唐鱼和野生型唐鱼雌、雄亲本，分别置于4个不同的水族箱中，暂养2周后同时配对繁殖，产出的活体胚胎即为试验材料。试验用水为充分曝气的自来水，试验前配制0.1 mol/L NaHCO3和HCl溶液。
1.2方法
1.2.1 不同pH条件下受精卵的孵化 根据预试验结果，在pH为6.0～8.0时转基因唐鱼和野生型唐鱼受精卵的孵化率相似，配制pH分别为3.0～5.5，8.5～10.5的试验用水，以曝气自来水(pH 7.0)为对照组。在显微镜下筛选已受精的转基因唐鱼和野生型唐鱼活体胚胎，分别放入盛有500 mL不同pH试验水的烧杯中，每个烧杯中放30粒受精卵，每组设3个平行。在恒温(25 ℃±0.5 ℃)下静水孵化，孵化期间每隔4 h更换1/2试验水，并统计出膜的仔鱼数。
1.2.2 不同pH 条件下仔鱼的急性毒性试验 pH梯度设置同“1.2.1”节，仔鱼孵化出10 d后，从同批卵的孵化槽中选取转基因唐鱼和野生型唐鱼仔鱼各10尾，放入盛有不同pH试验水的1000 mL烧杯中，在恒温(25 ℃±0.5 ℃)下静水培育，每组设3 个平行。试验期间不投饵，每4 h更换一次试验水，维持稳定的pH。试验持续4 d。
1.2.3 pH急性毒性试验中仔鱼的存活系数 从同批卵的孵化槽中选取刚出膜的转基因唐鱼和野生型唐鱼仔鱼各50尾，放入盛有1000 mL试验水、pH为4.5～9.0的烧杯中。将烧杯置于恒温(25 ℃±0.5 ℃)培养箱中静水培育，每隔4 h更换一次试验水。每天记录、捞出死亡的仔鱼数，直至仔鱼全部死亡，计算不投饵存活系数(survival activity index, SAI)，其计算公式[9]为
。
其中：N为试验初始的仔鱼数；k为仔鱼全部死亡所需的天数；hi为第i天时仔鱼的累积死亡数。
1.3数据处理
试验数据均用平均值±标准误(mean±S.E.)表示，用SPSS 17.0软件进行方差分析，显著性水平设为0.05。急性毒性的LC50及其95%置信区间通过Probit过程来估算，依据95%置信区间有无重叠来判定两组之间的LC50差异显著性[10]。
2.1不同pH下唐鱼受精卵的孵化率
从表1可见：当pH低于3或高于10.5时，转基因唐鱼和野生型唐鱼的受精卵不能孵化；在酸性条件下，两种唐鱼的孵化率随pH的升高而升高；在碱性条件下，孵化率均随pH的升高而降低。在相同pH条件下，野生型唐鱼的孵化率高于转基因唐鱼(pH为9.0时除外)，但经卡方检验，二者无显著性差异(P>0.05)。持续观察发现，pH低于4.5和高于9.0时仔鱼畸形，48 h后无存活个体。
表1不同pH条件下转基因唐鱼和野生型唐鱼受精卵的孵化率(平均值±标准误)
Tab.1Thehatchingrates(mean±S.E.)ofthefertilizedeggsinthetransgenicandwild-typewhitecloudmountainminnowTanichthysalbonubesunderdifferentpHvalues
%
组别grouppH3 03 54 04 55 05 5对照(7 0)8 59 09 510 010 5转基因唐鱼transgenicT albonubes0 010 0±6 717 8±1 936 7±8 870 0±8 877 6±6 986 7±3 483 3±3 346 7±3 329 0±1 913 3±3 40 0野生型唐鱼wild-typeT albonubes0 016 7±3 420 0±3 341 3±5 178 0±1 981 0±1 988 9±1 985 7±1 944 3±5 131 0±1 914 3±2 00 0
2.2不同pH下仔鱼的急性毒性
从表2可见：当pH为5.0～9.0时，转基因唐鱼和野生型唐鱼仔鱼96 h内的死亡率均不高于10%;当pH低于4.0或高于10.0时，两种仔鱼96 h的死亡率均达到100%。
表2不同pH条件下转基因唐鱼和野生型唐鱼的平均死亡率
Tab.2Theaveragemortalityoftransgenicandwild-typewhitecloudmountainminnowTanichthysalbonubesunderdifferentpHvalues
%
pH24h转基因唐鱼野生型唐鱼48h转基因唐鱼野生型唐鱼72h转基因唐鱼野生型唐鱼96h转基因唐鱼野生型唐鱼3 0100 0100 03 566 776 7100 0100 04 063 353 366 783 386 7100 0100 04 510 00 016 723 333 333 343 336 75 00 00 010 00 010 00 010 010 05 50 00 00 00 00 00 00 00 08 50 00 00 00 00 00 00 00 09 00 00 00 00 010 010 010 010 09 510 010 013 320 020 023 323 330 010 090 070 0100 070 0100 010 5100 0100 0对照(7 0)0 00 00 00 00 00 00 00 0
从表3可见：在酸性环境中，转基因唐鱼仔鱼的半致死pH略高于野生型唐鱼；在碱性环境中，转基因唐鱼仔鱼的半致死pH略低于野生型唐鱼；在相同pH条件下，95%置信区间均重叠，两组间的LC50则无显著性差异。
表3不同pH条件下转基因唐鱼和野生型唐鱼的LC50
Tab.3TheLC50oftransgenicandwild-typewhitecloudmountainminnowTanichthysalbonubesunderdifferentpHvalues
组别grouppHLC50(95%置信区间95%confidenceinterval)24h48h72h96h野生型唐鱼酸性3．5～5．53 89(3 67～4 12)4 28(4 07～4 49)4 43(4 01～4 62)4 53(4 31～4 73)wild-typeT albonubes碱性8．5～10．59 85(9 65～10 10)9 80(9 59～10 00)9 56(9 36～9 79)9 53(9 33～9 76)转基因唐鱼酸性3．5～5．53 95(3 70～4 21)4 31(4 02～4 65)4 41(4 18～4 63)4 53(4 31～4 73)transgenicT albonubes碱性8．5～10．59 75(9 57～9 93)9 66(9 53～10 60)9 57(9 38～9 81)9 56(9 36～9 79)
2.3不同pH下唐鱼仔鱼的不投饵存活系数
从图1可见，在pH为4.5～8.5的条件下，转基因唐鱼和野生型唐鱼仔鱼的SAI均增长，并在pH为8.5时达最大值，pH升至9.0时， SAI下降；在相同的pH条件下，野生型唐鱼仔鱼的SAI高于转基因唐鱼仔鱼(pH为4.5时除外)。
图1 不同pH条件下唐鱼仔鱼的不投饵存活系数
Fig.1 Survival activity index (SAI) of the transgenic and wide-type white cloud mountain minnow Tanichthys albonubes under different pH values
pH直接影响与鱼类孵化相关的各种蛋白水解酶的活力，使鱼类孵化具有很强的pH依赖性[11]。鱼类胚胎在pH过低或过高的水体中都不能孵化，即使出膜，仔鱼也呈向背腹方向弯曲的畸形状[12]。四大家鱼胚胎存活的pH下限为6.0[13]，本试验结果表明，转基因唐鱼和野生型唐鱼受精卵孵化的适宜pH为5.0～8.5,说明唐鱼对酸性水体的敏感性不如四大家鱼，具有较强的酸适应能力。调查发现，唐鱼栖息在pH为4.34的环境中仍能正常生存[14]。本试验中，唐鱼受精卵的孵化对酸性水体并不敏感，可能与其长期生活的水体环境有关。一些淡水鱼类如青鱼Mylopharyngodonpiceu、草鱼Ctenopharyngodonidellus、鲢Hypophthamichthysmolitrix、鳙Aristchthysnobilis等对pH的适宜范围为4.6～10.2，鲤Cyprinuscarpio为4.4～10.4[15]。本试验中发现，转基因唐鱼和野生型唐鱼仔鱼适宜生存的pH为5.0～9.0，二者对pH变化的耐受性均较低，这可能与仔鱼对环境中不利因子的抵抗力较成鱼差有关。经检验，在相同pH条件下，转基因唐鱼和野生型唐鱼的孵化率及初孵仔鱼的存活率均无显著性差异，表明当水中pH变动较大时，转基因唐鱼并没有生存优势。
不投饵存活系数(SAI)可用来判断仔鱼活力和受精卵的质量[16]，SAI 值越大，受精卵的质量和仔鱼的活力就越好[17]。初孵唐鱼仔鱼的营养模式为卵黄营养，卵黄吸收完后依靠摄食饵料生活[18]，而唐鱼对开口饵料的选择较为狭窄，当水体中无适宜的开口饵料时，卵黄营养物质的质量将直接影响唐鱼仔鱼的存活。本试验结果表明，转基因唐鱼和野生型唐鱼的SAI在最适pH条件下分别为54.1和61.7，高于泥鳅Misgurunusanguillicaudatus(27.0)[16]、斜带石斑鱼Epinepheluscoioides(约25)[19]，而与黄鳍东方鲀Fuguxanthopterus(61.7)相近[20]，说明唐鱼具有较强的耐饥饿能力，这与陈国柱等[21]、樊佳佳等[22]的研究结果一致。野外调查发现，唐鱼繁殖期较长，繁殖期饵料生物变动较大，仔鱼期可能遭受饥饿胁迫。本研究中发现，在不同pH条件下，野生型唐鱼仔鱼的SAI略高于转基因唐鱼，由此推测，当转基因唐鱼和野生型唐鱼初孵仔鱼同处于缺乏适宜开口饵料的环境中时，转基因唐鱼仔鱼死亡更早，原因可能是转基因唐鱼仔鱼的表达消耗了卵黄中一部分营养物质，导致其正常生理代谢所需营养物质减少。
综上所述，在不同pH条件下，转基因唐鱼的孵化率、仔鱼耐受性和仔鱼耐饥饿能力均低于野生型唐鱼。因此，若转基因唐鱼进入自然水域中，也不会威胁野生唐鱼的生存。
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Abstract：The hatching rate and survival were compared between wild and transgenic white cloud mountain minnowTanichthysalbonubesexpressing red fluorescent protein exposed to different pH values (3.5 to 5.5, and 8.5 to 10.5) for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h and the survival activity index (SAI) of the hatched larvae was measured at different pH values from 4.5 to 9.5. The results showed that the wild white cloud mountain minnow had slightly higher hatching rate than the transgenic ones, with suitable pH from 5.0 to 8.5. There was slightly higher 96 h survival rate in the transgenic larvae than in the wild larvae while the newly hatched wild larvae showed higher SAI than the transgenic larvae. It was found that both larvae had pH tolerance of 5.0 to 9.0, without significant difference, indicating that there are no significant differences in pH tolerance between the transgenic and wild white cloud mountain minnow.
Key words：transgene;Tanichthysalbonubes; pH; survival activity index (SAI)
DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.01.006
文章编号：2095-1388(2014)01-0027-04
收稿日期：2013-05-09
基金项目：国家“863”高技术研究发展计划(2009AA10Z105);广东省科技计划项目(2010B020308002);广东省海洋渔业科技推广专项子项目(A200899F01)
中图分类号：S917.4
文献标志码：：A