摘要：在实验室条件下,研究了不同水温(16、26℃)和不同药物剂量 [15、45 mg/kg(鱼体质量)]下,氟苯尼考(FF)及其代谢物氟苯尼考胺(FFa)在德国镜鲤Cyprinus carpio mirror体内的残留消除规律。试验采用混饲口灌给药,在16、26℃水温条件下,以15 mg/kg(鱼体质量)剂量给药;在26℃水温条件下,以15、45 mg/kg(鱼体质量)剂量给药,于给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24、72、120、168、216、264 h分别取鱼体肌肉、肝胰脏和肾脏组织,采用高效液相色谱荧光检测法测定鱼体各组织中FF和FFa的含量。结果表明:鱼体各组织中的FF和FFa,高温组较低温组消除快,高剂量组较低剂量组消除慢;高水温(26℃)下,用药后168 h时鱼体肌肉中的FF检测不出,而FFa浓度为36.3 μg/kg,低水温(16℃)下,用药后264 h时鱼体肌肉中的FF浓度为23 μg/kg,而FFa浓度为49 μg/kg;低剂量组在用药后168 h时,鱼体肌肉中的FF和FFa的浓度之和为36 μg/kg,而高剂量组在用药后264 h时,鱼体肌肉中的FF和FFa的浓度之和为59 μg/kg;药物在德国镜鲤各组织中的消除顺序依次为肌肉＞肝胰脏＞肾脏。
关键词：德国镜鲤;氟苯尼考;氟苯尼考胺;水温;剂量;残留
氟苯尼考(florfenicol,FF)又称氟甲砜霉素,是美国先灵—保雅(Schering-Plough)公司研制成功的一种氯霉素类广谱抗菌药物,在化学结构上以甲砜基(CH3SO2)取代了氯霉素结构中致再生障碍性贫血的主要基团(-NO2),降低了其对动物和人体的毒性[1-3]。氟苯尼考自上市以来首先应用在水产养殖业中,尤其是氯霉素被列为禁用药物后,该药成为了氯霉素最理想的替代品。FF主要应用于由气单胞菌、假单胞菌、链球菌、弧菌、屈挠杆菌、分支杆菌、巴斯德氏菌、诺卡氏菌等细菌性鱼类疾病的防治[4-5]。FF在水产动物细菌性疾病防治上已被广泛应用,长期低剂量使用药物和随意加大药物剂量等盲目用药现象非常普遍,这不仅会引起致病细菌产生耐药性,而且会造成药物在鱼体内残留,影响水产品质量安全。中国、欧盟及美国均对动物组织中FF的最大残留量进行了规定。FF在动物组织中的主要代谢产物为氟苯尼考胺(FFa)[6]。欧盟、加拿大以及中国均以FF和FFa的浓度之和作为标示残留物[3]。
目前,FF在水产养殖动物,如大西洋鲑、虹鳟、鳕鱼、鳗鲡及对虾体内的代谢动力学方面的研究已有报道[7],但有关不同水温、不同给药剂量下FF及其代谢物FFa在德国镜鲤Cyprinus carpio mirror体内代谢和残留规律的研究尚未见报道。德国镜鲤是人工选育的淡水养殖优良品种,是出口韩国的主要品种之一,经济价值较高。但其抗逆性差,对病原菌易感染,极易发生暴发性鱼病。韩国对输韩水产品药残指标控制严格,规定了40种药物的残留限量,氟苯尼考就是其中之一。本研究中,作者利用高效液相色谱荧光检测法对不同水温、不同剂量、不同时间下,FF和FFa在德国镜鲤肌肉、肝胰脏和肾脏组织中的残留规律进行了分析比较。研究结果可为制定该药在水产品中最高残留限量和休药期提供科学依据,对水产养殖中科学规范地使用FF和保证水产品质量安全具有重要意义。
1.1 材料
试验样品为德国镜鲤,由长春市九台鱼种场提供,平均体质量为(223±26)g,将其暂养在0.4 m×0.5 m×0.8 m水族箱内,供氧充足,采用加热棒调节和控制水温。
氟苯尼考(FF)标准体为德国Dr.Ehrenstorfer公司产品(含量99.0%),氟苯尼考胺(FFa)标准体为加拿大全资公司产品,氟苯尼考原粉(含量96%)由中国西安瑞特动物药业有限公司提供;乙腈、色谱纯为Fisher公司产品,正己烷、二氯甲烷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、丙酮、三乙胺均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 溶液的配制
1)磷酸盐缓冲液。准确称取NaH2PO4·2H2O 27.6 g和Na2HPO4·12H2O 71.6 g分别溶于1 L蒸馏水中,配成0.2 mol/L的溶液,将两种溶液按体积比为 39∶61混合后即为磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。
2)洗脱液。A液为0.01 mol/L的NaH2PO4溶液,用磷酸调节溶液的pH至2.8;B液为乙腈。将A液与B液按体积比为3∶2混合均匀后即为洗脱液。
1.2.2 仪器及色谱条件
1)高效液相色谱仪。Waters 1525泵,717自动进样器,2475荧光检测器及Breeze色谱工作站, IKA T25 digital组织捣碎机,XiangYi L-550离心机,IKA MS3 digital振荡器及HGC-24A氮吹仪。
2)色谱条件。NaH2PO4与乙腈溶液的体积比为3∶2,其中NaH2PO4溶液由0.01 mol/L NaH2PO4、0.005 mol/L十二烷基硫酸钠和0.10%三乙胺配制而成,用磷酸调节溶液的pH至4.5,流速为0.6 mL/min。色谱柱为Waters symmetry C18,柱温为30℃;荧光检测器激发波长为225 nm,发射波长为280 nm。
1.2.3 给药方式及样本的采集 将氟苯尼考原粉均匀混入鱼饲料中,加水搅成糊状,配成所需浓度。试验共分3组:A组,在水温26℃下按15 mg/kg(鱼体质量)剂量给药;B组,在水温16℃下按15 mg/kg(鱼体质量)剂量给药;C组,在水温26℃下按45 mg/kg(鱼体质量)剂量给药,直接将药灌入试验鱼前肠,无回吐者用于试验。于给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24、72、120、168、216、264 h分别取5尾鱼,取其背脊两侧的肌肉、肝胰脏和肾脏3种组织,于-20℃下保存待分析。
1.2.4 样品分析 将冷冻保存的组织样品于室温下自然解冻。准确称取肌肉2 g,肝胰脏、肾脏各1 g,分别放于15 mL离心管中,加入1 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0),涡旋振荡混匀2 min,加入3 mL丙酮继续涡旋振荡混匀2 min,以8 000 r/min离心8 min。将上清液转移到另一支15 mL的离心管中,向离心管中加入3 mL二氯甲烷,涡旋振荡混匀2 min,再以8 000 r/min离心5 min,弃去上层水相。置氮吹仪上于50℃下吹干,用1 mL洗脱液溶解残渣,涡旋振荡1 min,加入3 mL正己烷去脂,再涡旋振荡混匀1 min,以10 000 r/min离心10 min,弃去正己烷,重复去脂一遍,水相过滤,待测[8]。标准曲线浓度范围:FF为 10～50 000 μg/L,FFa为 2～2 000 μg/L。以 FF浓度 50、100、200、500 μg/L,FFa浓度10、20、40、100 μg/L,对3种组织空白样品加标计算回收率。
FF和FFa色谱峰尖且对称,肌肉、肝胰脏和肾脏中的杂质和标准物质峰分离良好(图1)。FF及FFa的线性范围内,以特征峰面积与相应质量浓度作标准曲线,相关系数R=0.999 9。按3倍信噪比(S/N=3)计算FF和FFa的检出限分别为5、1 μg/kg。肌肉、肝胰脏和肾脏组织中的回收率均在80%以上。测得的批内精密度和批间精密度均小于5.5%,可以确认本试验方法满足试验分析要求。
图1 FF和FFa色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of florfenicol and florfenicol amine
注:A标准品;B肌肉加标准品;C肝胰脏加标准品;D肾脏加标准品。
Note:A,The chromatogram of standard substance;B,The chromatogram of muscle with standard substance;C,The chromatogram of hepatopancreas with standard substance;D,The chromatogram of kidney with standard substance.
2.1 不同水温下各组织中FF和FFa的残留量
在16、26℃水温下,以剂量15 mg/kg(鱼体质量)给鱼单次口服FF药饵后,鱼体肌肉、肝胰脏和肾脏组织中药物浓度-时间曲线如图2、图3和图4所示。
从图2可见:鲤肌肉中的FF浓度在不同水温下的变化趋势有所不同,16℃水温下,肌肉中的FF浓度在12 h时达到峰值7.97 mg/kg;26℃水温下,肌肉中的 FF浓度在 6 h时达到峰值 8.69 mg/kg。16、26℃水温下,肌肉中的FFa浓度均在72 h时迅速达到峰值,分别为0.88、0.62 mg/kg。16℃水温下,264 h时肌肉中的 FF浓度为 23 μg/kg,而FFa浓度为4 9 μg/kg;2 6℃ 水温下,168 h时肌肉中的 FF检测不出,而FFa浓度为36.3 μg/kg。
图2 不同水温下FF和FFa在鱼体肌肉中的药时曲线
Fig.2 The concentration time curve of florfenicol and florfenicol amine in muscle at different water temperature
从图3可见:16、26℃水温下,肝胰脏组织中的FF浓度在4 h时均达到峰值,分别为18.54、26.50 mg/kg,之后处于缓慢的吸收消除过程;而FF浓度均在72 h时达到峰值,分别为0.63、0.73 mg/kg。26℃水温下,168 h肝胰脏中的FF检测不出,而FFa浓度为42 μg/kg;16℃水温下,264 h肝胰脏中的FF浓度为55 μg/kg,而FFa浓度为67 μg/kg。
图3 不同水温下FF和FFa在鱼体肝胰脏中的药时曲线
Fig.3 The concentration time curve of florfenicol and florfenicol amine in hepatopancreas at different water temperature
从图4可见:16、26℃水温下,肾脏组织中的FF浓度分别在12 h和4 h时达到峰值,分别为19.78、27.48 mg/kg,之后处于缓慢的消除过程; FFa浓度分别在120 h和72 h时达到峰值,分别为1.52、1.27 mg/kg。26℃水温下,168 h时肾脏中的FF检测不出,而FFa浓度为42 μg/kg;16℃水温下,264 h时肾脏中的FF浓度为67 μg/kg,而FFa浓度为116 μg/kg。
图4 不同水温下FF和FFa在鱼体肾脏中的药时曲线
Fig.4 The concentration time curve of florfenicol and florfenicol amine in kidney at different water temperature
本研究结果表明,低温组鱼体各组织中FF的吸收要比高温组慢,待达到峰值后低温组各组织中FF药物的代谢也较高温组慢。
2.2 不同药物剂量下各组织中FF和FFa的残留量
在26℃水温下,以剂量15、45 mg/kg(鱼体质量)分别给鱼口服1次FF药饵后,鲤肌肉、肝胰脏和肾脏组织中药物浓度-时间曲线如图5、图6和图7所示。
从图5可见:剂量为15、45 mg/kg时,鲤肌肉中的FF浓度的变化趋势稍有不同,肌肉中的FF浓度分别在6 h和12 h时达到峰值,分别为8.69、19.78 mg/kg;FFa浓度均在72 h时达到峰值,分别为0.62、1.62 mg/kg。
图5 不同给药剂量下FF和FFa在鱼体肌肉中的药时曲线
Fig.5 The concentration time curve of florfenicol and florfenicol amine in muscle at various doses
从图6可见:剂量为15、45 mg/kg时,鲤肝胰脏中FF浓度的变化趋势大体相同,在4 h和6 h时分别达到峰值,分别为26.50、37.75 mg/kg; FFa浓度分别在72 h、24 h时达到峰值,分别为0.73、2.23 mg/kg。
图6 不同给药剂量下FF和FFa在鱼体肝胰脏中的药时曲线
Fig.6 The concentration time curve of florfenicol and florfenicol amine in hepatopancreas at various doses
从图7可见:剂量为15、45 mg/kg时,鲤肾脏中的FF浓度在4 h、6 h时达到峰值,分别为27.48、38.02 mg/kg;FFa浓度均在72 h时达到峰值,分别为1.27、3.89 mg/kg。
图7 不同给药剂量下FF和FFa在鱼体肾脏中的药时曲线
Fig.7 The concentration time curve of florfenicol and florfenicol amine in kidney at various doses
本研究结果表明,在不同给药剂量下,高剂量组代谢较低剂量组慢,剂量为15 mg/kg(鱼体质量)时,用药后168 h时鱼体肌肉、肝胰脏和肾脏中的 FF和 FFa浓度之和分别为 36、42、42 μg/kg;剂量为45 mg/kg(鱼体质量)时,用药后264 h时鱼体肌肉、肝胰脏和肾脏中的FF和FFa浓度之和分别为59、163、307 μg/kg。
3.1 FF和FFa在德国镜鲤组织中的分布和消除
从FF和FFa在鱼体肌肉、肝胰脏和肾脏中的药时曲线可以看出,在同一给药剂量(15 mg/kg)不同水温(16、26℃)下,FF和FFa在各组织中的浓度均呈现先升高后降低的变化趋势。低温组(16℃)各组织中的药物浓度在达峰前低于高温组(26℃),达峰后低温组药物浓度的消除也较高温组慢。两个水温下,各组织中同一个时间点的药物浓度,以肝胰脏吸收最快,26℃水温时药物进入鱼体后0.5 h时肝胰脏中的浓度就迅速升高,达12.2 mg/kg,是肌肉的7.7倍多,其次是肾脏,肌肉中最低。余培建等[9]也报道了FF在欧洲鳗鲡体内首先在肝胰脏、肾脏迅速吸收,而达峰后药物在肝胰脏内消除较慢,在肾脏内消除最慢。其消除顺序依次为肌肉＞肝胰脏＞肾脏。刘永涛等[10]报道了18、28℃水温下斑点叉尾鮰组织中的药物含量,高水温时FF和FFa之和在斑点叉尾鮰体内消除更快,FF和FFa在鮰组织中残留水平由高到低依次为肾脏＞肝胰脏＞肌肉。冯敬宾等[11]报道了以10 mg/kg(鱼体质量)剂量给药后在22℃和28℃水温下罗非鱼体内FF的浓度,结果显示,高温组罗非鱼体内药物消除速度快于低温组。
从FF和FFa在鱼体肌肉、肝胰脏和肾脏中的药时曲线还看出,在同一水温(26℃)不同给药剂量(15、45 mg/kg)下,高剂量组同一时间点鱼体各组织中的药物浓度均高于低剂量组,而且肝胰脏和肾脏中药物浓度远大于肌肉中浓度,高剂量组中鱼的代谢较低剂量组慢,低剂量组在用药后168 h时鱼体肌肉中的FF和FFa浓度之和为36 μg/kg,高剂量组在用药后264 h时鱼体肌肉中的FF和FFa浓度之和为59 μg/kg。王群等[7]也报道了以高低两种剂量(16、8 mg/kg)采用口服药饵的方法对中国对虾给药,高剂量组虾肌肉组织中的药物浓度远高于低剂量组,且肝胰脏中的药物浓度远大于肌肉中的药物浓度。
3.2 德国镜鲤在养殖过程中的休药期
本试验中对不同水温和不同给药剂量下FF和FFa在德国镜鲤肌肉、肝胰脏和肾脏中的残留进行了研究,为制定FF和FFa在水产品中的最高残留限量和休药期提供了科学依据。制定休药期不仅要考虑最高残留限量,还应该考虑水温等水环境状况[12-14]。世界各国规定最高残留限量差异很大,欧盟规定在有鳍鱼类肌肉中的残留限量为 1.0 mg/kg,加拿大规定在鲑科鱼体内的残留限量为0.8 mg/kg,中国规定在鱼类带皮肌肉中的残留限量为1.0 mg/kg,韩国对进口水生动物最高残留限量为0.2 mg/kg。德国镜鲤是出口韩国的主要养殖品种,根据本试验结果,26℃水温下,德国鲤肌肉中的FF和FFa浓度之和在用药后168 h仅为36 μg/kg,16℃水温下,各组织中的FF和FFa浓度之和在用药后264 h仍为72 μg/kg。以本研究数据可制定向韩国出口德国镜鲤在养殖中的休药期,如果以15 mg/kg的剂量给药,最高残留限量为200 μg/kg时,养殖水温为26℃时休药期需168 h以上,养殖水温为16℃时休药期需264 h以上。如果加大药量,休药期还要相应延长。
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Effects of water temperature and drug dosage on florfenicol and florfenicol amine residues in Germany mirror carp
Abstract：The depletion of florfenicol and its metabolite florfenicol amine residues was studied in Germany mirror carp Cyprinus carpio mirror under different water temperature(16,26℃)and doses(15,45 mg/kg body weight)of the drug.The Germany mirror carp were orally administrated for the drug at a dose of 15 mg/kg body weight at water temperature of 26℃(group A)and 16℃(group B)only once,and at a dose of 15 mg/kg and 45 mg/kg body weight at water temperature of 26℃(group C).Then the muscle,hepatopancreas and kidney tissues were collected from the Germany mirror carp killed 0.5,1,2,4,6,8,12,24,72,120,168,216,and 264 h after oral drug administration.The florfenicol(FF)and florfenicol amine(FFa)levels in the tissues were detected by reverse phase high performance liquid chromatography(HPLC)with fluorescence detection.It was found that the FF and FFa in three tissues were more rapidly depleted and eliminated at high water temperature than at low water temperature,and slower at high dosage than at low dosage.At 26℃,the FFa level in the issues was found to be at 36.3 μg/kg and no FF was detected 168 h after oral drug administration.At 16℃,however,the FF level in the issues was at 23 μg/kg and the FFa at 49 μg/kg 264 h after oral drug administration.At a dosage of 15 mg/kg body weight,the sum of FF and FFa levels in the muscles was found to be 36 μg/kg 168 h after oral drug administration,and at a dosage of 45 mg/kg body weight,59 μg/kg 264 h after oral drug administration.The order of elimination of the drug in various tissues was ranged as:muscle＞hepatopancreas＞kidney.
Key words：Cyprinus carpio mirror;florfenicol(FF);florfenicol amine(FFa);water temperature;dosage;residues
中图分类号：S965.116
文献标志码：A
收稿日期：2012-06-08
基金项目：国家现代农业产业技术体系项目(CARS-46-29)
文章编号：2095-1388(2013)02-0127-06