表1 正交试验因素水平表
Tab.1 The factors and levels of the orthogonal experiment
因素factor水平level A加酶量/% quantity of the enzyme B C D温度/℃temperature pH 时间/min time 1 0.06 40 4.5 30 2 0.08 45 5.5 50 3 0.10 50 6.5 70
摘要：通过对多肋藻Costaria costata基本成分的测定与对多肋藻中活性成分岩藻聚糖硫酸酯提取工艺进行优化,研究了提取的岩藻聚糖硫酸酯对小鼠血清高血脂的抑制作用。结果表明:多肋藻的水分、灰分、蛋白质、脂肪含量分别为10.55%、15.40%、11.13%、2.00%(质量分数,下同),多肋藻的总膳食纤维、碘、甘露醇含量分别为48.05%、0.10%、11.30%。正交试验结果表明,岩藻聚糖硫酸酯的优化提取工艺为酶加量0.10%、温度50℃、pH 5.5、酶解时间30 min,在此条件下岩藻聚糖硫酸酯的提取率为1.859%,总糖与总硫酸根含量分别为1.416% 和0.972%。建立高血脂症小鼠模型,采用岩藻聚糖硫酸酯粗提物对其灌胃,试验结果表明:各剂量组对小鼠血清总胆固醇(TC)均具有显著抑制作用(P＜0.05);剂量高于500 mg/(kg·d)时,对小鼠血清甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)具有显著抑制作用(P＜0.05)。多肋藻岩藻聚糖硫酸酯粗提物对高血脂症中的三项指标均具显著抑制作用,表明其有一定的降血脂功能。
关键词：多肋藻;岩藻聚糖硫酸酯;提取工艺;降血脂作用
海带在中国栽培历史悠久,栽培区域广,产量大,但海带的精深加工产品少,对其中生物活性成分的开发应用还远不够,这主要受海带种类限制以及加工技术及综合利用水平低等因素影响。
多肋藻Costaria costata隶属于海带目Laminaria -les海带科Laminariaceae多肋藻属Costaria,在中国无自然分布,在亚洲主要分布于日本及朝鲜半岛海域,是营养价值较高的一年生大型褐藻[1]。近年来,对多肋藻的研究逐渐增多,主要是因其含有丰富的生物活性物质岩藻聚糖硫酸酯。本研究中,作者以大连沿海栽培的多肋藻为原料,对多肋藻中活性成分岩藻聚糖硫酸酯的提取及其血脂调节作用进行了研究,旨在为培育栽培新品种,综合利用褐藻优势品种提供科学依据。
1.1 材料
多肋藻为大连沿海栽培的品种。
试验动物 SPF小鼠雌、雄各半,体质量为(20±2)g,购自大连医科大学辽宁省SPF动物重点实验室。
主要试剂:纤维素酶、果胶酶购于上海蓝季科技发展有限公司,木瓜蛋白酶购于北京化学试剂公司;乙醇体积分数为95%,其他试剂均为分析纯;总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;非诺贝特胶囊为法国利博福尼制药公司产品,其化学名为2-[4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基]-2-甲基-丙酸甲基乙酯。
主要仪器与设备:FW100高速万能粉碎机、LD5-2A离心机、HH-4数显恒温水浴锅。
1.2 方法
1.2.1 基本成分的测定方法 用常压干燥法、马福炉灼烧法、凯氏定氮法和索氏抽提法分别测定水分、灰分、蛋白质和脂肪含量[2],用过碘酸氧化法测定甘露醇含量[3],用酶重量法测定总膳食纤维含量[4],用SC/T 3010-2001中的方法测定碘含量[5]。
1.2.2 岩藻聚糖硫酸酯提取工艺的优化 采用复合酶解法[6]提取岩藻聚糖硫酸酯粗品,采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[7],采用盐酸水解-硫酸钡重量法测定硫酸根含量[8],采用次甲基蓝分光光度法测定岩藻聚糖硫酸酯含量[9]。
岩藻聚糖硫酸酯、总糖、硫酸根含量(%)=各项在粗品中的含量(%)×粗品的提取率(%)。
1.2.3 粗提物的血脂调节作用分析
1)饲料制作。高脂饲料配方为猪油10%、胆固醇2%、胆盐0.5%、基础料87.5%。制作时,将基础料(正常饲料)粉碎与胆固醇、胆盐逐步混匀后,注入饲料加工机中边搅拌边加水,缓慢倒入融化状态的猪油,待混合搅拌均匀后挤压成型,用烘箱烘干,常温下保存。
2)动物分组及试验。将SPF小鼠暂养3 d后,随机分为8组:正常对照组、高脂模型对照组、阳性对照组和岩藻聚糖硫酸酯组(F1～F5组),每组10只小鼠。除正常对照组饲喂基础饲料外,其他试验组均饲喂高脂饲料;饲养方式为自由取水取食。
每天投喂饲料之前对各试验组小鼠灌胃1次,灌胃体积均为2 mL;正常对照组及高脂模型对照组灌胃蒸馏水;阳性对照组灌胃非诺贝特,剂量为每天40 mg/kg;F1～F5组灌胃不同剂量的岩藻聚糖硫酸酯粗提物,剂量分别为每天100、300、500、700、900 mg/kg。
3)试验指标的测定。小鼠连续给食并灌胃14 d时,从眼框采血,然后断颈处死。血液在无菌试管中保存,对血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量进行测定,测定方法参照南京建成生物工程有限公司试剂盒说明书进行。
1.3 数据处理
采用SPSS 17.0进行单因素方差分析,用t检验法进行组间多重比较,以P＜0.05表示有显著性差异。
2.1 基本成分
经测定,多肋藻中各项基本成分的含量分别为水分10.55%、灰分15.40%、蛋白质11.13%、脂肪2.00%、总膳食纤维48.05%、碘0.10%、甘露醇11.30%(质量分数,下同)。将多肋藻基本成分的含量转化为纯干基含量,并与中国科学院卫生研究所颁布的干海带[10]基本成分的含量转化为干基含量值对比发现,多肋藻干基中蛋白质、灰分、脂肪的含量分别为12.44%、17.22%和2.24%,较普通干海带干基中蛋白质、灰分、脂肪含量分别高出9.4%、14.79%和0.11%。
2.2 正交试验
采用复合酶法(纤维素酶、果胶酶、蛋白酶质量比为3∶1∶1,三者的酶活力分别为18.70、22.97、15.90 U/mg)提取岩藻聚糖硫酸酯。选取加酶量、温度、pH值和时间4个因素,以岩藻聚糖硫酸酯、总糖和总硫酸根含量为试验指标,设计4因素3水平的正交试验,试验设计方案及试验结果见表1、表2。
表1 正交试验因素水平表
Tab.1 The factors and levels of the orthogonal experiment
因素factor水平level A加酶量/% quantity of the enzyme B C D温度/℃temperature pH 时间/min time 1 0.06 40 4.5 30 2 0.08 45 5.5 50 3 0.10 50 6.5 70
对正交试验结果进行极差分析(表2),结果表明:以岩藻聚糖硫酸酯含量为试验指标的因素影响程度依次为C＞B＞D＞A,最佳提取方案为A3B3C3D1,最佳试验组合为A3B3C2D1;以总糖含量为试验指标的因素影响程度依次为C＞D＞B＞A,最佳提取方案为A3B3C2D1,最佳试验组合为A3B3C2D1;以总硫酸根含量为试验指标的因素影响程度依次为C＞A＞D＞B,最佳提取方案为A3B2C2D3,最佳试验组合为A3B3C2D1。
由于 3个试验指标的最佳试验组合均为A3B3C2D1,且在此组合条件下,岩藻聚糖硫酸酯、硫酸根与总糖含量均明显高于其他试验组,因此,本研究中确定最佳提取工艺组合为A3B3C2D1,即酶加量为0.10%,温度为50℃,pH为5.5,酶解时间为30 min。
对确定的最佳提取工艺进行验证试验,以确保工艺的可靠性和正确性,将酶加量为0.10%,温度为50℃,pH为5.5,酶解时间为30 min的提取方法重复进行5次试验,并测定提取物中岩藻聚糖硫酸酯、总糖和总硫酸根含量。结果表明,最佳提取条件下岩藻聚糖硫酸酯含量为 1.859% ± 0.092%,总糖含量为1.416%±0.064%,总硫酸根含量为0.972%±0.057%,试验结果的重复性较好,表明此提取方案的稳定性程度较高,与何云海等[11]报道的用戊聚糖复合酶酶解提取其他种类海带岩藻聚糖硫酸酯含量为1.845%的结果相近。
表2 复合酶酶解多肋藻的正交试验设计及试验结果
Tab.2 The design and the results of orthogonal test in the sea weed Costaria costata hydrolysates made by a mixture of enzymes
因素factor试验号No. A加酶量/% quantity of the enzyme B C D温度/℃temperature pH 时间/min总糖含量/% the content of polysaccharides总硫酸根含量/% the content of SO2-4time岩藻聚糖硫酸酯含量/% the yield rate of fucoidan 1 1.196 0.995 0.466 2 1 2 2 2 1.039 0.970 0.735 1 1 1 1 3 1.623 1.079 0.732 4 2 1 2 3 1.261 0.976 0.956 1 3 3 3 5 1.798 1.082 0.875 6 2 3 1 2 1.415 0.799 0.446 2 2 3 1 7 1.725 1.245 0.864 8 3 2 1 3 0.928 0.617 0.789 3 1 3 2 9 3 3 2 1 1.286 1.394 1.180 1.628 K21.491 1.255 1.397 1.393 K31.514 1.643 1.715 1.271 R 0.228 0.388 0.536 0.357 K＇11.890 1.465 1.014 K1 1.015 1.072 0.804 1.181 K＇20.952 0.890 1.137 1.005 K＇31.109 1.114 1.135 0.891 R＇ 0.157 0.225 0.333 0.290 K″10.644 0.762 0.567 0.785 K″20.759 0.800 0.902 0.682 K″30.889 0.731 0.824 0.826 R″0.245 0.069 0.335 0.144
2.3 岩藻聚糖硫酸酯对小鼠血脂的调节作用
从表3可见:高脂模型组中小鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量均显著性高于正常对照组(P＜0.05),说明通过试验期间高脂饲料的喂养,成功建立了小鼠高血脂模型[10];阳性对照组和各岩藻聚糖硫酸酯组小鼠血清中的TC含量均显著性低于高脂模型组(P＜0.05),且当岩藻聚糖硫酸酯剂量为100～900 mg/(kg·d)时,随着灌胃剂量的增加小鼠血清中TC含量降低,当岩藻聚糖硫酸酯剂量为900 mg/(kg·d)时,TC含量低于阳性对照组水平,更接近于正常对照组;当岩藻聚糖硫酸酯剂量为500～900 mg/(kg·d)时,小鼠血清中的TG含量均显著性低于高脂模型组(P＜0.05),但无明显浓度趋势,当岩藻聚糖硫酸酯剂量为 700 mg/(kg·d)时,TG含量低于阳性对照组水平;当岩藻聚糖硫酸酯剂量为500～900 mg/(kg·d)时,小鼠血清中的LDL-C含量均显著性低于高脂模型组(P＜0.05),接近正常水平,但无明显浓度趋势;HDL-C含量在阳性对照组中呈最高水平,但岩藻聚糖硫酸酯剂量组与正常对照组均无显著性差异(P＞0.05)。
岩藻聚糖硫酸酯的主要成份为α-L-岩藻糖-4 -硫酸酯[12],存在于海藻细胞的细胞壁基质中,具有抗氧化[13-15]、 抗肿瘤[16]、 抗动脉粥样化[17]、 抗衰老[18]、保护肝脏[19]等活性作用。添加的纤维素酶主要用于分解细胞壁。多肋藻中富含果胶质、蛋白质,在浸提过程中会增加浸提液的黏稠度[20],使岩藻聚糖硫酸酯不易溶出。本研究中优化了多肋藻岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺,得到最佳提取方案为酶加量0.10%、酶解温度50℃、酶解pH 5.5、酶解时间30 min,在此条件下提取产物中岩藻聚糖硫酸酯含量为 1.859%±0.092%,总糖含量为1.416%±0.064%,总硫酸根含量为 0.972%± 0.057%。
表3 多肋藻岩藻聚糖硫酸酯对小鼠血脂的影响(平均值±标准差,n=10)
Tab.3 The effect of fucoidan from the sea weed Costaria costata on the mice blood-lipid(mean±S.D.,n=10)
注:a表示与正常对照组相比有显著性差异(P＜0.05);b表示与高脂模型组相比有显著性差异(P＜0.05)。
Note:a,Significant difference compared with normal control group(P＜0.05);b,Significant difference compared with hyperlipidemia model group(P＜0.05).
组别group高密度脂蛋白/(mmol·L-1) high density lipoprotein正常对照组normal control group剂量/(mg·kg-1·d-1) dose总胆固醇/(mmol·L-1) total cholesterol甘油三酯/(mmol·L-1) triglyceride低密度脂蛋白/(mmol·L-1) low density lipoprotein 1.21±0.28 0.25±0.11 0.90±0.32 0.96±0.29 1.01±0.61高脂模型组hyperlipidemia model group 2.07±0.97a0.48±0.18a1.32±0.55a1.23±0.38阳性对照组positive control group 40 1.39±0.37b0.31±0.24b0.89±0.48b1.37±0.36 F1 100 1.50±0.59b0.38±0.22 1.22±0.63 1.11±0.44 F2 300 1.54±0.37b0.41±0.12 1.16±0.62 1.21±0.49 F3 500 1.47±0.28b0.32±0.16b0.95±0.57b1.04±0.52 F4 700 1.44±0.58b0.30±0.51b0.91±0.79b1.29±0.55 F5 900 1.36±0.64b0.36±0.26b0.92±0.61b
高血脂是不良饮食导致的常见病症,总胆固醇是血脂的直观体现,甘油三酯是致动脉粥样化的一项重要的临床指标,低密度脂蛋白起到运输体内胆固醇的作用,而高密度脂蛋白在血脂过高时,可作为逆向转运胆固醇的载体,加快血液中胆固醇的分解[21]。归纳降血脂药物的作用方式一般有 3种[22-24]:第一种是活性物质促进高密度脂蛋白的合成;第二是胆固醇在肠道中被分解为胆汁酸,活性物质与胆汁酸作用,加快胆固醇的分解、转化,使其不被人体吸收;第三种是活性物质直接包裹住肠道中的脂质,减少肠道对脂类的吸收,使得血脂中的胆固醇受到控制。本试验结果表明,岩藻聚糖硫酸酯能显著抑制小鼠高脂摄食过程中血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的升高,高密度脂蛋白含量较正常对照组有所增高,但作用不显著,因此,推测岩藻聚糖硫酸酯降血脂的作用方式可能为后两种,其作用机理还有待进一步研究。
参考文献：
[1] 由学策,曹淑青,王含茹,等.Costaria costata常温人工育苗的研究[J].大连水产学院学报,2011,26(1):17-22.
[2] 大连轻工业学院.食品分析[M].北京:中国轻工业出版社, 1994.
[3] 范晓,严晓军.海藻化学分析方法[M].北京:学苑出版社, 1996:59-62.
[4] 王丽婷.利用海带废渣制备高活性膳食纤维工艺技术研究[D].大连:大连水产学院,2010.
[5] 中华人民共和国农业部.SC/T 3010-2001海带碘含量的测定[S].北京:中国标准出版社,2001.
[6] 何云海,汪秋宽,张婷.海带岩藻聚糖硫酸酯酶解工艺及分离和纯化研究[J].沈阳农业大学学报,2007,38(2):215-219.
[7] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:上海科学技术出版社,1987:6-7.
[8] 张惠芬,李宝才,范家恒,等.盐酸水解-硫酸钡重量法测定硫酸酯化多糖硫酸基含量方法考察[J].食品科学,2002,28(5): 107-111.
[9] 刘红英,薛长湖,李兆杰,等.海带岩藻聚糖硫酸酯测定方法的研究[J].青岛海洋大学学报,2002,32(2):236-240.
[10] 李钦,陆红,陈爱君,等.薯藤多糖降血脂作用试验研究[J].中国临床药理学与治疗学,2008,13(12):1370-1374.
[11] 何云海,汪秋宽,刘红丹.用复合酶酶解提取海带岩藻聚糖硫酸酯的工艺研究[J].大连水产学院学报,2006,21(1):55-58.
[12] Chevolot L,Mulloy B,Ratiskol J,et al.A disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae [J].Carbohydr Res,2000,328:529-535.
[13] 董平,薛长湖,李兆杰,等.岩藻聚糖硫酸酯低聚糖的制备及其抗氧化活性研究[J].中国海洋大学学报,2006,36(增刊): 59-62.
[14] 任丹丹,李景娟,李佰磊,等.海带岩藻黄素对油脂氧化的抑制作用研究[J].大连海洋大学学报,2012,27(6):564-566.
[15] 吴超,任丹丹,陈倩,等.海带岩藻黄素对小鼠脂质过氧化抑制作用的影响[J].大连海洋大学学报,2011,26(5):428-431.
[16] 许中平,王海仁.酶解海带的制作及其抗肿瘤和免疫调节作用的研究[J].食品科学,1999(9):51-53.
[17] 黄荣,王玉琴.海带多糖对实验性大鼠动脉粥样硬化的预防作用[J].南通大学学报,2008,28(5):351-353.
[18] 杨伟丽,刘青,祁梅,等.海带多糖对小鼠的抗衰老作用[J].兰州大学学报,2009,35(4):46-48.
[19] 任丹丹,汪秋宽,张甜翠,等.海带岩藻聚糖硫酸酯对四氯化碳致肝损伤小鼠的保护作用[J].华中农业大学学报,2009,28(6):764-766.
[20] 赵前程,滕钊,汪秋宽,等.复合酶法提取海带多糖的研究[J].沈阳农业大学学报,2007,38(2):220-223.
[21] 付慧,汪秋宽,何云海,等.多肋藻渣膳食纤维对小鼠降血脂作用的研究[J].大连海洋大学学报,2012,27(3):200-204.
[22] 王嵩,刘煜德,吴伟,等.高脂、蛋氨酸饮食及CPn感染对小鼠动脉粥样硬化的影响[J].心脑血管病防治,2009,9(4):259-261.
[23] 李德远,徐战,黄利,等.海带岩藻糖胶对大鼠饮食性高血脂症的影响[J].食品科学,2001,22(2):92-95.
[24] 陈建澍,潘伟槐,童微量,等.大麦β-葡聚糖对小鼠血脂水平的影响[J].大麦科学,2002(3):23-25.
The extraction and serum lipids reducing function of fucoidan from seaweed Costaria costata
Abstract：The approximate composition of seaweed Costaria costata was analyzed,the extraction of fucoidan was optimized from the sea weed and the inhibition of high serum lipid in mice by the fucoidan was studied.It was found that the Costaria costata contained 10.55%moisture,15.40%ash,11.13%protein,2.00%fat(mass percent,et sequentia),48.05%total dietary fiber,0.10%iodine,and 11.30%mannitol.The orthogonal test showed that the best extraction of fucoidan was observed under the conditions of enzyme addition of 0.10%,temperature 50℃,pH 5.5,and hydrolysis period 30 min with the extraction rate of 1.859%,the total sugar of 1.416%and sulfate radicals of 0.972%.The hyperlipemia mice by intragastrical injection of the crude fucoidan extract showed that significant inhibition of serum total cholesterol(TC)(P＜0.05),specifically inhibition of the mice serum triglyceride(TG)and low density lipoprotein(LDL-C)at a dose of over 500 mg/(kg·d)(P＜0.05).The fucoidan extract from the Costaria costata had significant inhibition of the three indices of hyperlipidemia mentioned obove,indicating that the fucoidan functions as high-lipid reducing.
Key words：Costaria costata;fucoidan;extract-technology;hypocholesterolemic effect
中图分类号：R151
文献标志码：A
收稿日期：2012-05-29
基金项目：公益性行业(农业)科研专项(200903030)
文章编号：2095-1388(2013)01-0094-05