摘要：研究了不同浓度的3种微生态制剂对水质及刺参Apostichopus japonicus幼参(鲜体质量为0.7053 g± 0.0046 g)生长和免疫的影响。试验设9个处理组,分别投喂添加浓度为2、4、8 mL/m3的3种免疫增强剂、3种复合芽孢杆菌和3种EM菌;另设1个对照组,投喂基础饲料,每组均设2个重复。试验在100 L的PVC塑料桶中进行,试验水体为80 L,每桶放35头幼参。日投饵2次,投饵量为幼参体质量的5%;日换水1次,换水量为水体的1/5,换水后将微生态制剂直接泼洒至水体中。结果表明:在水体中泼洒3种微生态制剂,能明显改善水质,泼洒8 mL/m3的EM菌对水体的净化作用最有效,该处理组水体中的氨氮(
N)和亚硝酸氮(
N)含量最低,分别比对照组降低36.0%和56.6%;投喂添加3种微生态制剂饲料的处理组,幼参的特定生长率均显著高于对照组(P＜0.05),添加8 mL/m3的免疫增强剂对幼参生长的影响最明显,该处理组幼参的特定生长率比对照组提高31.8%;幼参体腔液中的酸性磷酸酶(ACP)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LSZ)活力均与添加微生态制剂的剂量呈正比,添加8 mL/m3免疫增强剂的处理组幼参的ACP和CAT活力最高,显著高于其他组(P＜0.05),分别比对照组提高164.0%和54.0%,添加8 mL/m3EM菌的处理组幼参的LSZ活力最高,显著高于其他组(P＜0.05)。
关键词：刺参;免疫增强剂;复合芽孢杆菌;EM菌;水质;生长;免疫
刺参养殖业在20世纪90年代初具规模,2010年,中国刺参总产量超过10万t,产值达到200多亿元。但因刺参病害的频发,严重影响了该产业的健康稳定发展。而刺参病害主要通过药物防治,大剂量重复使用药物对刺参养殖生态环境,特别是微生态环境造成了严重破坏。因此,对水体微生态环境具有调节作用的微生态制剂逐渐成为人们研究的焦点。
微生态制剂又称益生菌,Kozasa[1]首次将其应用到水产养殖,此后得到迅速推广。已有研究表明,微生态制剂对刺参生长和免疫有良好的改善作用[2-9]。微生态制剂,不仅可以降解水中氨氮(N)、亚硝酸氮(N)和硫化氢等有害物质,还能改善养殖对象肠道微生态环境和分泌消化酶,提高饲料转化率,预防疾病,促进生长[10]。本试验中,作者研究了3种微生态制剂在不同浓度下对水质、刺参Apostichopus japonicus幼参生长和免疫的影响,旨在为其在刺参养殖中的应用提供科学依据。
1.1 材料
试验用幼刺参(简称幼参)由大连金砣水产食品有限公司提供,幼参规格一致,鲜体质量为(0.7053±0.0046)g。
3种微生态制剂为免疫增强剂、复合芽孢杆菌和EM菌,其中免疫增强剂主要成分为枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、产朊假丝酵母等活菌(60×108cfu/mL)以及免疫肽、氨基酸和独特生物活性因子,为深褐色液体,购自青岛绿海洋生物技术有限公司;复合芽孢杆菌主要成分为多种有益芽孢杆菌(30×108cfu/mL),为白色液体,购自大连神龙生物技术有限公司;EM菌主要成分为海洋芽孢杆菌、海洋放线菌、海洋酵母等(50×108cfu/g),为红色固体粉末,购自潍坊东方海洋生物科技研发中心。生产上,一般将EM菌加水配制成菌液后使用,1 g/m3(固体粉末)≈1 mL/m3(液体菌液)。
1.2 方法
1.2.1 试验设计与日常管理 试验设9个处理组,其中A1、A2、A3处理组分别投喂添加浓度为2、4、8 mL/m3的免疫增强剂饲料;B1、B2、B3处理组分别投喂添加浓度为2、4、8 mL/m3的复合芽孢杆菌饲料;C1、C2、C3处理组分别投喂添加浓度为2、4、8 mL/m3的EM菌饲料;另设1个对照组,只投喂基础饲料(主要成分为大叶菜藻液)。由于条件限制,每组设2个重复。试验在100 L的PVC塑料桶中进行,试验水体为80 L,每桶放35头幼参。日投饵2次(7:00、17:00),投饵量为幼参体质量的5%。上午观察幼参的摄食情况,确定投饵量,下午清除残饵和粪便。日换水1次,换水量为水体的1/5,换水后将微生态制剂直接泼洒至水体中。试验期间,水温为12～16℃,盐度为31～32,连续充气。每隔12 d(换水前)测定水体中的pH值及N和N含量。试验共进行60 d。
1.2.2 水质检测 用pHS-25型测定仪测定pH值,采用纳氏比色法测定N含量,采用萘乙二胺分光光度法测定N含量[11]。
1.2.3 生长指标的测定 试验结束24 h后,对每组幼参总体质量进行称量,计算特定生长率(SGR)和成活率:
成活率(%)=100×试验终末的幼参存活数/试验初始的幼参总数,
SGR(%/d)=100×(ln Wf-ln W0)/t,
式中:W0和Wf分别为试验初始和终末时幼参的均体质量(鲜质量,g);t为试验时间(d)。
1.2.4 体腔液中免疫酶活力的测定 试验结束24 h后,从每组随机挑选幼参5头,抽取体腔液测定其免疫酶活力。
酸性磷酸酶(ACP)的测定:ACP分解磷酸苯二钠,产生游离酚和磷酸,酚在碱性溶液中与4 -氨基安替吡啉作用,经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物,根据红色深浅测定酶活力的高低。酶活力定义:100 mL体腔液在37℃下与底物作用30 min,产生1 mg酚为1个酶活力单位。
过氧化氢酶(CAT)的测定:CAT分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止,剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物,在405 nm处测定其生成量,据此可计算出CAT的活力。酶活力定义:每毫升体腔液每秒钟分解 1 μmol H2O2的量为一个酶活力单位。
溶菌酶(LSZ)的测定:一定浓度的混浊菌液中,由于LSZ能水解细菌细胞壁上肽聚糖使细菌裂解而浓度降低,透光度增强,然后根据透光度的变化来推测LSZ的含量。
以上3种酶活力均采用南京建成生物工程研究所生产的专用试剂盒进行测定。
1.3 数据处理
试验数据均以平均值±S.E.表示,用 SPSS 11.7软件进行相关性检验、方差分析和LSD多重比较,以P＜0.05表示有显著性差异。
2.1 微生态制剂对养殖水体水质的影响
2.1.1 pH值 整个养殖过程中,处理组和对照组养殖水体中的pH值都在7.6～7.8之间波动,各组间均无显著性差异(P＞0.05)。
2.1.2N含量 从表1可见,在试验浓度范围内,3种微生态制剂对养殖水体中N的抑制作用均随制剂浓度的增加而明显提高。A1组在整个试验阶段与对照组均无显著性差异(P＞0.05);A2组在试验的第12～24天与对照组无显著性差异(P＞0.05),在试验的第36～60天显著低于对照组(P＜0.05);A3组在整个试验阶段均显著低于对照组和A1、A2组(P＜0.05),试验结束时水体中的N含量比对照组降低了18.3%。B1组水体中的N含量(除第12天外)显著低于对照组(P＜0.05);B2、B3组在整个试验阶段均显著低于对照组和B1组(P＜0.05); B3组效果最显著,试验结束时N含量比对照组降低了32.5%。C1组在试验的第12～36天与对照组无显著性差异(P＞0.05),在试验的第48～60天显著低于对照组(P＜0.05);C2、C3组在整个试验阶段均显著低于对照组和C1组(P＜0.05); C3组效果最显著,试验结束时N含量比对照组降低了36.0%。
2.1.3N含量 从表2可见,在试验浓度范围内,3种微生态制剂对养殖水体中N的抑制作用均随制剂浓度的增加而明显提高。A1组在试验的第12～36天与对照组无显著性差异(P＞0.05),在试验的第48～60天显著低于对照组(P＜0.05);A2组在试验的第12～24天与对照组无显著性差异(P＞0.05),在试验的第36～60天显著低于对照组(P＜0.05);A3组在整个试验阶段均显著低于对照组和A1、A2组(P＜0.05),试验结束时水体中N含量比对照组降低了35.1%。B1组仅在试验结束时与对照组有显著性差异(P＜0.05);B2、B3组在整个试验阶段均与对照组、B1组均有显著性差异(P＜0.05),试验结束时B2、B3组水体中N含量分别比对照组降低了46.2%和49.0%。C1组在整个试验阶段与对照组无显著性差异(P＞0.05);C2组在试验的第36～60天与对照组有显著性差异(P＜0.05); C3组在整个试验阶段与C1组、C2组、对照组均有显著性差异(P＜0.05),C3组作用最明显,试验结束时N含量比对照组降低了56.6%。
表1 不同试验时期3种微生态制剂对养殖水体中N含量的影响
Tab.1 The effects of the three probiotics onN levels in different test periods
注:同一种微生态制剂中,同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P＜0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P＞0.05),下同。
Note:In the same probitics,the means with the different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters within the same column are not significant differences,et sequentia.
组别group ρ(N)/(mg·L-1) 12 d 24 d 36 d 48 d 60 d对照 0.239±0.021a0.348±0.012a0.432±0.013a0.483±0.025a0.508±0.013aA1 0.225±0.017a0.351±0.023a0.421±0.006a0.478±0.021a0.497±0.008aA2 0.218±0.014a0.334±0.011a0.405±0.014b0.435±0.007b0.463±0.013bA3 0.188±0.032b0.303±0.012b0.356±0.013c0.388±0.016c0.415±0.021cB1 0.217±0.014a0.319±0.007b0.381±0.015b0.427±0.007b0.458±0.007bB2 0.188±0.022b0.262±0.016c0.327±0.014c0.354±0.015c0.366±0.014cB3 0.173±0.038b0.233±0.022d0.284±0.009d0.322±0.016d0.343±0.008dC1 0.228±0.016a0.336±0.014a0.413±0.016a0.452±0.022b0.481±0.009bC2 0.204±0.031b0.296±0.009b0.369±0.005b0.407±0.017c0.447±0.024cC3 0.172±0.022c0.221±0.018c0.271±0.012c0.318±0.014d0.325±0.015d
表2 不同试验时期3种微生态制剂对养殖水体中N含量的影响
Tab.2 The effects of the three probiotics onN levels in different test periods
组别group ρ(N)/(mg·L-1) 12 d 24 d 36 d 48 d 60 d对照 0.051±0.013a0.084±0.022a0.125±0.006a0.198±0.011a0.251±0.012aA1 0.047±0.009a0.075±0.008a0.118±0.012a0.173±0.014b0.210±0.015bA2 0.041±0.005a0.068±0.013a0.106±0.021b0.169±0.009b0.196±0.007bA3 0.038±0.021b0.056±0.002b0.108±0.007c0.136±0.014c0.163±0.011cB1 0.040±0.012a0.071±0.005a0.113±0.015a0.187±0.013a0.198±0.023bB2 0.024±0.007b0.042±0.016b0.087±0.013b0.125±0.008b0.135±0.006cB3 0.019±0.014b0.030±0.022b0.078±0.002b0.110±0.006b0.128±0.014cC1 0.052±0.011a0.077±0.005a0.120±0.021a0.184±0.007a0.238±0.003aC2 0.048±0.009a0.073±0.013a0.106±0.008b0.151±0.017b0.176±0.011bC3 0.026±0.006b0.035±0.007b0.073±0.004c0.098±0.009c0.109±0.016c
2.2 微生态制剂对幼参生长的影响
试验期间各组的成活率均为100%,说明微生态制剂对幼参成活率没有影响。从表3可见,各处理组的特定生长率均显著高于对照组(P＜0.05), 3种微生态制剂对幼参生长的促进作用随浓度的增加而增强。其中,免疫增强剂作用最显著,A1、A2、A3组的特定生长率分别比对照组提高13.7%、19.4%和31.8%,B1、B2组的特定生长率与B3组有显著性差异(P＜0.05),C1、C2、C3组间有显著性差异(P＜0.05)。
2.3 微生态制剂对幼参免疫的影响
2.3.1 ACP活力 从图1可见,各处理组幼参体腔液中的ACP活力均显著高于对照组(P＜0.05);在试验浓度范围内,幼参的ACP活力均随微生态制剂浓度的增加而显著升高,其中免疫增强剂作用最明显,A1、A2、A3组间均有显著性差异(P＜0.05),分别比对照组提高 70.6%、130.1%和164.0%;而复合芽孢杆菌和EM菌各组间差异则相对不明显。
表3 不同种类和不同浓度的微生态制剂对幼参生长的影响
Tab.3 The effects of the kinds and concentrations of the probiotics on growth in the sea cucumber
组别group 初始均体质量 initial body weight/g 终末均体质量 final body weight/g 特定生长率specific growth rate/(%·d-1)对照 0.7048±0.0065a1.3657±0.086a1.102±0.066aA1 0.7007±0.0038a1.4862±0.018b1.253±0.069bA2 0.7037±0.0085a1.5501±0.046c1.316±0.053cA3 0.7006±0.0053a1.6752±0.053f1.452±0.033eB1 0.7031±0.0057a1.4835±0.002b1.244±0.026bB2 0.7098±0.0026a1.5179±0.041b1.267±0.089bB3 0.7069±0.0036a1.6262±0.034d1.388±0.016dC1 0.7051±0.0040a1.4911±0.133b1.248±0.075bC2 0.7027±0.0030a1.5569±0.031c1.326±0.119cC3 0.7067±0.0031a1.6442±0.035e1.407±0.015d
2.3.2 CAT活力 从图1可见:各处理组幼参体腔液中的CAT活力均显著高于对照组(P＜0.05);在试验浓度范围内,幼参的CAT活力均随着微生态制剂浓度的增加而显著升高,其中免疫增强剂的作用最明显,A1、A2组的CAT活力与A3组间有显著性差异(P＜0.05),分别比对照组提高18.0%、28.4%和54.0%。
2.3.3 LSZ活力 从图1可见:除A1、B1、C1组外,其他处理组幼参体腔液中的LSZ活力均显著高于对照组(P＜0.05);在试验浓度范围内,幼参的LSZ活力均随着微生态制剂浓度的增加而显著升高,其中EM菌作用最明显,C1、C2、C3组间有显著性差异(P＜0.05),分别比对照组提高20.0%、60.7%和100.7%。
由于养殖场试验条件的限制,各试验组只设置了两个重复,相对于3个重复的结果来说,会有一定的误差。但本试验结果基本上还是可以表明水质和幼参各项指标的变化趋势。
3.1 微生态制剂对幼参养殖水环境的影响
有研究表明,在水体中添加微生态制剂能在一定程度上改善水质,其作用原理是利用益生菌排斥水体中的致病菌和有害菌,通过分泌抑菌物质,竞争生态位来抑制致病菌的增长,同时还能直接影响水中氮循环细菌数量而促进水体的氮循环,达到降低水体N含量的目的[12-13]。在养殖过程中,残饵、粪便是污染的主要来源,N、N含量升高,引起水质恶化,同时也为某些条件性致病菌提供了营养,增加了刺参致病的危险。水体中加入微生态制剂后,通过氨化、氧化、硝化等作用,降解有机废物,减小其危害性,使水体环境稳定[14-15]。
图1 3种微生态制剂对幼参体腔液中ACP、CAT、LSZ活力的影响
Fig.1 The effect of the three probiotics on activities of acid phosphatase,catalase,and lysozyme in coelomic fluid of the sea cucumber
注:标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P＜0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P＞0.05)。
Note:The means with the different letters are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters are not significant differences.
本试验中,各组水体中N和N含量均随养殖时间的延长而不断升高,对照组升高较快而处理组升高较慢,说明微生态制剂无法完全降解由粪便或残饵产生的有害物质,但3种微生态制剂对N和N均有一定的降解作用。这与徐琴等[16]使用4种微生态制剂处理对虾育苗水体有效地降低了N和N含量,以及王路平等[17]在幼参养殖试验中使用3种微生态制剂有效地降低了N和N含量的结果相同。在本试验中,复合芽孢杆菌、EM菌净化水质的效果明显,与其成分中含有多种具有对水环境协同作用的益生菌有关;免疫增强剂净化水质的效果较差,可能与免疫增强剂主要成分多为营养型菌种有关。因此,选择微生态制剂时,应根据具体用途选择相应作用的益生菌种。另外,生产中应及时补充益生菌,使其在水体中形成优势种群,发挥其改善水环境的作用。在冬季幼参保苗期间需要使用大量升温水,若使用微生态制剂改善水质,可以减少换水量,降低对水资源的浪费,节能减排,降低生产成本。
3.2 微生态制剂对幼参生长的影响
微生态制剂本身含有大量的营养物质,同时随着它们在动物消化道内的定植、繁衍和代谢,可产生动物生长所需的维生素、氨基酸、促生长因子以及蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维酶等多种酶,从而增强养殖对象的营养代谢,增加机体对养分的消化利用,促进其生长。另一方面,微生态制剂还可通过竞争抑制以及产生抑菌物质等方式抑制有害细菌,从而起到预防病害的作用。试验表明,微生态制剂对刺参生长有一定的促进作用。如袁成玉等[18]发现,使用光合细菌和芽孢杆菌投喂幼参能明显促进幼参生长;周慧慧等[19]采用分离自刺参肠道的益生菌投喂稚参,显著提高了稚参的成活率和生长率。
本试验结果表明,各处理组生长率显著高于对照组,说明3种微生态制剂可在一定程度上促进幼参生长。不同浓度之间,试验范围内浓度越大对幼参生长的促进作用越显著。这可能与投喂浓度高,有益菌可以更快进入和定植幼参肠道,提高幼参消化吸收率有关。不同微生态制剂之间,以免疫增强剂的促生长效果最显著,可能与其含有免疫肽和乳杆菌,快速改善刺参消化代谢有关。对于刺参消化道内益生菌的定植规律和作用周期尚需进一步探讨。
3.3 微生态制剂对幼参免疫的影响
刺参通过体腔液中具有吞噬能力的细胞对侵入的外来物质进行吞噬清除,借助细胞内的溶酶体酶,如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶等对异物进行裂解和消化,以达到免疫保护的效果。ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶和巨噬细胞内最有代表性的水解酶之一。CAT是一种含Fe(Ⅲ)-原卟啉的氧化还原酶,主要用于快速催化分解代谢中产生的过氧化氢,对生长发育和代谢活动具有重要意义。LSZ是一种碱性蛋白,通过水解细菌细胞壁中的乙酰氨基多糖,破坏和消除侵入体内的异物。陈文典等[20]使用枯草芽孢杆菌胶囊投喂中华绒螯蟹,可以明显提高其LSZ和ACP活力。徐琴等[21]研究表明,微生态制剂是良好的非特异性免疫增强剂,能有效地增强机体的免疫力,提高抗逆能力,使中国对虾表现出最佳的生长状态。本试验中,各处理组幼参体腔液中的ACP、CAT、LSZ活力均显著高于对照组,表明添加微生态制剂可以有效地提高幼参的免疫力。其中免疫增强剂对ACP和CAT活力的增强作用最显著,EM菌对LSZ活力的增强作用最明显,随着制剂用量的增加作用效果显著。益生菌的种类和用量是微生态制剂作用的关键因子,生产上应根据不同用途选择含有所需益生菌的微生态制剂,亦可尝试添加混合益生菌剂,以达到改善水环境、防病和促生长的效果。
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Effects of three probiotics on water quality and growth in sea cucumber Apostichopus japonicus
Abstract：The effects of three probiotics including immunostimulants,bacillus compound,and EM on water quality,growth and immunity of sea cucumber Apostichopus japonicus was investigated.The sea cucumber with body weight of(0.7053±0.0046)g was reared in 100 L PVC plastic barrels at a stocking density of 35 individuals per barrel,and fed the basal diet(as a control)and the diets containing three types of immunostimulants,bacillus compounds and EM twice a day at a rate of 2,4,and 8 mL/m3with duplication,twice a day at feeding rate of 5%. The probiotics were added into the barrels after the water was exchanged one fifth once a day.The results showed that addition of the probiotics led to improvement of water quality,especially in the group with addition of EM in 8 mL/m3,whichN andN contents were found to be the minimum,36.0%and 56.6%lower than those in the control group.There were significant higher specific growth rate(SGR)in the sea cucumber fed the diets containing the probiotics than that in the control group(P＜0.05),the maximum in the sea cucumber fed the diets containing the immunostimulants in 8 mL/m3,31.8%higher than that in the control group.The activities of acid phosphatase(ACP),catalase(CAT)and lysozyme(LYS)in the coelomic fluid were found to be increased along with increase in the probiotics concentrations,maximum in the sea cucumber fed the diets containing the immunostimulants in 8 mL/m3,significant higher than those in other groups(P＜0.05),164.0%and 54.0%higher than those in the control group.The sea cucumber fed the diets containing the EM in 8 mL/m3had the maximal activities of lysozyme(LSZ),significant higher than the sea cucumber in other groups did(P＜0.05).
Key words：Apostichopus japonicus;immunostimulant;bacillus compound;effective microorganisms(EM);water quality;growth;immunity
中图分类号：S968.9
文献标志码：A
收稿日期：2012-05-15
基金项目：辽宁省教育厅科研项目(2009S025)
文章编号：2095-1388(2013)01-0021-06