外源蛋白酶对虹鳟生长和肠道组织结构的影响

(1.上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;2.农业部淡水水产种质资源重点试验室,上海201306)

摘要：为考察饲料中添加蛋白酶对虹鳟Oncorhynchus mykiss生长性能、肌肉成分以及肠、胃蛋白酶活性和前肠组织结构的影响,配制了鱼粉含量为35%的高鱼粉饲料、鱼粉含量为28%的低鱼粉饲料 (补充赖氨酸、蛋氨酸达到与高鱼粉饲料一致的水平),以及在低鱼粉饲料中添加175 mg/kg蛋白酶PT的蛋白酶饲料,用3种饲料饲喂初始体质量为 (52.1±0.5)g的虹鳟60 d。结果表明:高鱼粉组、低鱼粉组和蛋白酶组虹鳟的增重率分别为98.46%、88.48%、96.82%,饲料系数分别为1.36、1.52、1.41,低鱼粉组虹鳟的增重率最低,饲料系数最高;在低鱼粉饲料中添加蛋白酶后,鱼体增重率提高了9.42%,饲料系数降低了7.80%(P＞0.05),且与高鱼粉组无显著性差异 (P＞0.05);各组虹鳟的肌肉成分间无显著性差异 (P＞0.05);与低鱼粉组相比,蛋白酶组虹鳟的胃、肠蛋白酶活性及肠道皱襞高度、面积均有所提高 (P＜0.05),达到了与高鱼粉组基本一致的水平。本研究结果表明,在虹鳟低鱼粉饲料中添加蛋白酶可提高胃、肠蛋白酶活性,改善肠道组织结构,改善鱼体生长性能。

虹鳟Oncorhynchus mykiss是一种名优冷水养殖鱼类,具有营养丰富、肉质鲜嫩的特点。虹鳟属肉食性鱼类,对蛋白质的需求比较高,虹鳟养殖技术规范——配合颗粒饲料SC/T 1030.7—1999[1]中规定,虹鳟成鱼阶段的饲料粗蛋白含量≥40%。通常情况下,饲料配方中需要35%～40%的鱼粉方可满足其营养需求。但是,近年来鱼粉价格昂贵,资源短缺,为降低养殖成本,有效的方法就是在补充限制性氨基酸的基础上,以植物性蛋白替代部分鱼粉,同时添加酶制剂,如蛋白酶等,以提高植物性蛋白源的利用率。乌兰等[2]在饲料中添加0.05%、0.10%、0.15%耐高温酶制剂 (以蛋白酶为主)饲喂奥尼罗非鱼56 d,添加量为0.10%时,显著提高了鱼体增重率,降低了饲料系数。刘鼎云等[3]在鱼粉含量为26.4%的饲料中添加175 mg/kg蛋白酶AG,凡纳滨对虾的增重率提高了10.8%,达到了与高鱼粉组 (33%鱼粉含量)基本一致的增重水平。此外,对鲤[4]、奥尼罗非鱼[5]的研究表明,在低鱼粉饲料中添加蛋白酶,能促进鱼体生长,提高营养物质的消化率和肠道蛋白酶活性。

目前,有关蛋白酶应用于水产动物方面的报道,主要集中在对温水性鱼类的研究上,而对冷水性鱼类的研究相对较少。本试验中,作者以虹鳟为研究对象,在鱼粉含量为35%的饲料 (高鱼粉饲料)中,以豆粕和肉骨粉等蛋白源代替20%鱼粉,配制低鱼粉饲料 (鱼粉含量28%),在低鱼粉饲料中添加175 mg/kg蛋白酶PT,考察蛋白酶PT对虹鳟生长性能的影响,旨在为蛋白酶在水产饲料中的合理利用提供依据。

1 材料与方法

试验用虹鳟购于黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼类试验站,初始平均体质量为 (52.1±0.5)g。选取体质健壮、规格一致的个体135尾,随机分配于9个自动充气循环养殖缸内 (0.60 m×0.60 m× 0.50 m),每缸放15尾鱼;共3个处理组,每个处理组设3个重复。

1.2.1 试验设计及试验饲料以鱼粉含量为35%的饲料作为高鱼粉饲料组;在高鱼粉饲料中,用豆粕、肉骨粉替代鱼粉制成鱼粉含量为28%的饲料作为低鱼粉饲料组,同时补充晶体赖氨酸(0.09%)和晶体蛋氨酸 (0.05%),使赖氨酸和蛋氨酸的含量达到与高鱼粉组一致的水平;在低鱼粉饲料中,添加175 mg/kg蛋白酶PT(加拿大JEFO营养公司生产并提供,为细菌发酵产物,是一种耐高温的微碱性丝氨酸蛋白酶)作为蛋白酶饲料组。饲料配方及营养成分组成见表1。各组原料均粉碎并过40目,逐级混合后,由颗粒饲料机(浙江省新昌县陈氏机械厂生产,KL系列)制成粒径为2.5 mm的硬颗粒沉性饲料,晾干备用。

表1 饲料配方及营养成分组成
Tab.1 Ingredients and approximate composition of diet w/%

注:1)饲料 (均为质量分数,%)中还包括啤酒酵母4,鱼油3,豆油3,磷酸二氢钙1,氯化胆碱0.5,矿物质预混料0.5,维生素预混料0.6;2)维生素和微量元素在饲料中的添加量 (mg/kg饲料)包括VA 2 500 IU/kg,VD 2 400 IU/kg,VC 150,VE 30,VK 10,VB110, VB220,VB540,VB610,VB71,VB115,VB120.02,Inositol 400,Zn 100,Fe 150,Cu 3,Mn 20,I 0.8,Co 0.12,Se 0.1,Mg 100。
Note:1)The other dietary ingredients include(%),brewers yeast 4,fish oil 3,soybean oil 3,monocalcium phosphate 1,choline chloride 0.5, mineral premix 0.5,and vitamin premix 0.6;2)Vitamin and mineral premix(mg/kg diet):VA 2 500 IU/kg,VD 2 400 IU/kg,VC 150,VE 30, VK 10,VB110,VB220,VB540,VB610,VB71,VB115,VB120.02,Inositol 400,Zn 100,Fe 150,Cu 3,Mn 20,I 0.8,Co 0.12,Se 0.1,and Mg 100.

组别group饲料配方ingredients鱼粉fish meal豆粕soybean meal肉骨粉meat and bone meal次粉wheat middling麸皮wheat bran赖氨酸Lys-HCl蛋氨酸DL-Met蛋白酶PT proteinase高鱼粉组high fish meal diet 35 18 9.0 19.40 6低鱼粉组low fish meal diet 28 25 12.5 18.76 3 0.09 0.05蛋白酶组protease diet 28 25 12.5 18.74 3 0.09 0.05 0.0175组别group营养成分组成approximate composition水分moisture 粗蛋白crude protein 粗脂肪crude fat 粗灰分crude ash 赖氨酸Lys高鱼粉组high fish meal diet 7.26 42.92 10.50 12.51 2.64低鱼粉组low fish meal diet 7.82 42.26 10.45 12.52 2.64蛋白酶组protease diet 7.35 42.21 10.41 12.54 2.64

1.2.2 饲养管理试验开始前,将虹鳟暂养3周以适应环境。试验正式开始时,3个处理组分别投喂高鱼粉饲料、低鱼粉饲料和蛋白酶饲料,每天投喂2次 (8:30,15:30),日投饲量为鱼体质量的1.5%～2.5%,并根据温度、摄食和鱼体生长情况适当调整,使各组保持基本一致的摄食水平,以每次投饲后无残饵为宜。试验期间水温为8～14℃,溶氧为6～7 mg/L,pH为7.24～7.78。养殖试验于上海海洋大学鱼类营养实验室进行,养殖周期为60 d。

1)生长性能。养殖试验结束后,鱼体饥饿24 h,称重各组鱼,计算增重率、饲料系数、特定生长率和成活率。

其中:Wt为终末平均体质量 (g);W0为初始平均体质量 (g);F为饲料摄入量 (g);t为饲养时间(d)。

2)肌肉基本成分分析。试验结束后,每缸取3尾鱼,每个处理组9尾,取背部白肌10 g左右,剪碎成均匀的混合物以测定虹鳟肌肉中的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量。其中,采用105℃恒重法 (GB/T 6435-86)测定水分,采用凯氏定氮法 (GB/T 6432-94)测定粗蛋白,采用氯仿-甲醇抽提法测定粗脂肪,采用550℃灰化法 (GB/T 6438-92)测定粗灰分。

3)胃和肠蛋白酶活力的测定。试验结束后,每缸取3尾鱼,每个处理组9尾,取肠和胃,于-80℃下保存,待测蛋白酶活力。测定时,在4℃下解冻肠和胃,用4℃去离子水漂洗,用纸吸干,称重,加入适量4℃缓冲液,剪碎后用匀浆机在冰浴中匀浆,匀浆液在4℃下以8 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定。其中,胃和胃糜添加0.1 mol/L的KCl-HCl缓冲液 (pH 1.5),肠添加0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液 (pH 8.5)[6]。采用福林酚试剂法测定蛋白酶活力[7]。

胃蛋白酶活力定义:在pH为1.5和40℃水浴中保温10 min,每g鲜样组织每min水解酪蛋白产生1 μg酩氨酸定义为一个酶活力单位 (U)。

肠蛋白酶活力定义:在pH为8.5[8]和40℃水浴中保温10 min,每g鲜样组织每min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为一个酶活力单位 (U)。

4)前肠组织切片。采样时,取前肠于波恩(Bouins)试剂中固定,用体积分数为100%的酒精冲洗,用不同浓度的酒精脱水,用二甲苯透明、石蜡包埋,固定在木块上,在切片机上连续切片(厚度为5 μm),然后贴片、烘片、脱蜡、复水、H.E染色、脱水透明、中性树胶封片,风干后,于Olympus光学显微镜下观察肠道结构并拍照。

试验数据采用 (平均数±标准差)表示,用SPSS 17.0进行单因素方差分析,如差异有显著性,用Duncan氏法进行多重比较,差异显著性水平设为0.05。

2 结果

养殖60 d后,各组虹鳟的生长性能见表2。低鱼粉组虹鳟的增重率低于高鱼粉组 (P＜0.05),而饲料系数却高于高鱼粉组 (P＜0.05);蛋白酶组虹鳟的增重率为96.82%,比低鱼粉组提高9.42%,饲料系数为1.41,比低鱼粉组降低7.80%;蛋白酶组虹鳟的增重率、饲料系数与高鱼粉组相比均无显著性差异 (P＞0.05);各处理组虹鳟肌肉水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量间均无显著性差异(P＞0.05)(表3)。

表2 对虹鳟生长性能的影响
Tab.2 Effects of various diets on growth performance in rainbow trout

注:同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异 (P＜0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异 (P＞0.05),下同。
Note:The means with the different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters within the same column are not significant differences,et sequentia.

组别group初始平均体质量/g initial body weight终末平均体质量/g final body weight增重率/% weight gain饲料系数food conversion rate SGR/(%·d-1) specific growth rate成活率/% survival rate高鱼粉组high fish meal diet 52.1±0.5 103.4±5.4 98.46±9.9b1.36±0.10a1.13±0.10 100.00±0.00低鱼粉组low fish meal diet 52.1±0.4 98.2±5.2 88.48±1.6a1.52±0.03b1.02±0.11 100.00±0.00蛋白酶组protease diet 52.1±0.4 102.6±7.1 96.82±10.3ab1.41±0.09ab1.08±0.13 100.00±0.00

表3 对虹鳟肌肉成分的影响
Tab.3 Effects of different diets on muscular approximate composition in rainbow trout w/%

组别group 水分moisture 粗蛋白crude protein 粗脂肪crude fat 粗灰分crude ash高鱼粉组high fish meal diet 76.83±0.09 19.42±0.84 2.22±0.01 1.43±0.11低鱼粉组low fish meal diet 76.70±0.04 19.74±0.90 2.23±0.02 1.47±0.04蛋白酶组protease diet 76.12±0.05 19.85±0.74 2.38±0.02 1.47±0.05

从表4可见:高鱼粉组和蛋白酶组虹鳟肠蛋白酶和胃蛋白酶活力均高于低鱼粉组 (P＜0.05),但蛋白酶组、高鱼粉组虹鳟肠蛋白酶和胃蛋白酶活力间无显著性差异 (P＞0.05)。

对虹鳟前肠组织切片,观察并测量前肠皱襞高度和面积。由表5可见,高鱼粉组和蛋白酶组前肠皱襞高度和面积均高于低鱼粉组 (P＜0.05),但高鱼粉组、蛋白酶组的前肠皱襞高度和面积均无显著性差异 (P＞0.05)。从图1-A、C可见,高鱼粉组和蛋白酶组肠绒毛发达,排列整齐完整,固有层结缔组织、黏膜肌和肠绒毛连接紧密;从图1-B可见,低鱼粉组肠绒毛的高度低于高鱼粉组和蛋白酶组 (P＜0.05),部分肠绒毛与黏膜肌分离,黏膜肌和结缔组织较疏松,肠绒毛变短且前端有损伤。

表4 对虹鳟肠、胃蛋白酶活力的影响
Tab.4 Effects of different diets on intestinal and gastric protease activities in rainbow trout U/g

组别group 肠intestine 胃gastric高鱼粉组high fish meal diet 1805.1±167.13b314.10±56.95b低鱼粉组low fish meal diet 1578.23±162.41a237.71±57.77a蛋白酶组protease diet 1843.13±157.01b341.87±14.09b

图1 虹鳟前肠组织结构 (×4)
Fig.1 The tissue structure of foregut in rainbow trout(×4)

注:A高鱼粉组前肠皱襞;B低鱼粉组前肠皱襞;C蛋白酶组前肠皱襞。R示皱襞,CT示结缔组织,MM示黏膜肌。
Note:A,Foregut plica in high fish meal group;B,Foregut plica in low fish meal group;C,Foregut plica in protease group.R,Indicates plica, CT,Indicates connective tissue,MM,Indicates muscularis mucosa.

表5 蛋白酶对虹鳟前肠组织结构的影响(n=6)
Tab.5 Effects protease addition on the structure of foregut tissue in rainbow trout(n=6)

组别group皱襞高度/μm foregut plica height皱襞面积/μm2foregut plica area高鱼粉组high fish meal diet 592.27±83.28b6574.64±153.68b低鱼粉组low fish meal diet 472.27±53.13a4562.65±56.57a蛋白酶组protease diet 600.38±36.73b7613.29±155.51b

3 讨论

Cheng等[9]和Gaylord等[10]的研究均表明,虹鳟能够有效利用饲料中添加的外源晶体氨基酸。但在本试验中,低鱼粉饲料补充赖氨酸、蛋氨酸后,尽管其赖氨酸、蛋氨酸达到与高鱼粉组一致的水平,但虹鳟的鱼体增重率仍显著低于高鱼粉组,仅相当于高鱼粉组的89.8%(表2),而饲料系数却显著升高。这说明,以植物蛋白、肉骨粉部分代替鱼粉后,单纯通过补充限制性氨基酸,仍难以达到理想的生长效果,其原因可能与植物蛋白、肉骨粉的消化率低以及缺乏一些未知生长因子等 (相对于鱼粉而言)有关[11-12],因此,通过在饲料中添加酶制剂,提高营养物质消化率,是减少鱼粉用量,提高替代蛋白源利用率的有效途径。

蛋白酶是催化分解肽键的一类酶的总称,能将蛋白质降解为小分子的蛋白胨、肽和氨基酸,从而提高蛋白质的消化利用率。冷向军等[13]在鱼粉含量为10%的饲料中添加175 mg/kg蛋白酶AG后,鲤增重率提高9.1%,饲料系数降低9.9%,同时也提高了肠道蛋白酶活性;乌兰等[14]在对奥尼罗非鱼的研究中,添加0.1%的金属蛋白酶,可提高前肠蛋白酶活力18.83%,肠道皱襞高度也得到显著提高;Drew等[15]用豌豆替代鱼粉,添加 250 mg/kg蛋白酶后,虹鳟摄食量显著增加,饲料系数显著降低;此外,蛋白酶应用在肉仔鸡[16]、仔猪[17]、奶牛[18]、异育银鲫[19]、草鱼[20]、黄颡鱼[21]等的研究均表明,蛋白酶具有促进动物生长、降低饲料系数、改善肠道组织结构、提高消化酶活性和饲料利用率的作用。添加外源性消化酶提高消化道酶活性的原因,一方面可能是外源性消化酶直接参与对饲料成分的分解,另一方面可能是促进了内源性消化酶的分泌,与外源酶共同作用,从而提高鱼体对营养成分的消化和吸收,促进鱼体生长。

本试验中,低鱼粉饲料组的虹鳟增重率及肠、胃蛋白酶活性最低,前肠组织学观察也表明肠绒毛有部分损伤,这来源于植物蛋白相对较低的消化率及抗营养因子的危害;在低鱼粉饲料中添加175 mg/kg蛋白酶后,虹鳟增重率、饲料系数均得到了改善,虽未达到显著水平,但与高鱼粉组相比,已无显著性差异;此外,虹鳟肠、胃蛋白酶的活性有显著提高,肠绒毛发达且排列整齐,皱襞高度和面积显著增加,增加了肠道对营养物质的吸收面积,这说明蛋白酶的添加能促进虹鳟肠道结构的改变,提高虹鳟对饲料的消化吸收率,从而促进其生长。

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Effects of supplemental protease on growth and intestinal tissue structure in rainbow trout Oncorhynchus mykiss

ZHANG Juan-juan1,LI Xiao-qin1,2,LENG Xiang-jun1,2,HAN Zhi-ying1,ZHANG Fei-ge1
(1.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources,Ministry of Agriculture,Shanghai 201306,China)

Abstract：Rainbow trout Oncorhynchus mykiss with an initial weight of(52.1±0.5)g was fed three diets containing high(35%fish meal,H group),low fish meal(28%fish meal,L group),and low fish meal supplemented with 175 mg/kg protease PT(S group)for 60 days to investigate the effects of protease on growth,muscle proximate composition,intestinal and gastric protease activities,and tissue structure in rainbow trout.The results showed that the weight gain was found to be 98.46%in H group,88.48%in L group and 96.82%in S group.The food conversion ratio was 1.36 in H group,1.52 in L group,and 1.41 in S group,the minimal weight gain,and the maximal food conversion ratio in the rainbow trout in L group.The weight gain was increased by 9.42%and food conversion ratio decreased by 7.80%in the rainbow trout in S group(P＞0.05),no significant difference compared with the rainbow trout in H group(P＞0.05).There were no significant differences in proximate muscle composition among rainbow trout fed the three diets(P＞0.05).There were significantly higher intestine and gastric protease activities,and foregut plica height and area in the rainbow trout in S group,almost the same level as in H group, than those in low fish meal diet(P＜0.05).It is concluded that the addition of protease in basical low fish meal diet leads to enhance intestine and gastric protease activities,and to improve the tissue structure of intestine and the growth performance in rainbow trout.

Key words：Oncorhynchus mykiss;protease;growth performance;intestine tissue structure

基金项目：上海市重点学科建设项目 (Y1101);上海市 “科技兴农”重点攻关计划项目 (2009-06-06)

作者简介：张娟娟 (1986-),女,硕士研究生。E-mail:jjzhang168@126.com

通信作者：冷向军 (1972-),男,教授,博士生导师。E-mail:xjleng@shou.edu.cn