李磊,黄清发,肖雨,孙建华,戚隽渊,孙振中
(上海市水产研究所上海市水产品质量监督检验站,上海200433)
摘要：在实验室条件下,研究了不同浓度的五氯酚钠溶液(0、1、2、3、4、5、10 mg/L)对鲫Carassius auratus的毒性作用,并采用药浴的方式研究了五氯酚钠在鲫体内不同时间段的药代谢动力学。结果表明:五氯酚钠对鲫的毒性作用很强,当药物浓度为10 mg/L时,药浴1 h后试验动物100%死亡;当药物浓度为2 mg/L时,试验动物健康存活,药浴96 h无死亡现象;将鲫在2 mg/L的五氯酚钠溶液中浸浴24 h后,药物迅速被鲫吸收,血浆中0.5 h五氯酚钠浓度就能达到11.5 ng/mL,1 h达到峰值12.0 ng/mL,但药物的代谢较慢,给药70 d后才检测不到药物;药物在肌肉中的代谢与血浆中类似,1 h达到峰值(11.84 ng/mL),比血浆中的峰浓度略低,药动学参数t1/2α、t1/2β、MRT0-t、Tmax、Cmax、AUC0-t和MAT分别为12.6 h、186.8 h、260.4 h、1 h、11.84 ng/mL、1106.5 ng/(mL·h)、222.5 h。
关键词：鲫;五氯酚钠;急性毒性;药代动力学;气相色谱法
五氯酚钠(Sodium pentachlorophenol,PCP)广泛应用于农业、工业生产中,如作为除草剂、杀虫剂、杀菌剂以及木材防腐处理等,在中国主要用它来进行池塘灭螺[1]。五氯酚钠具有良好的水溶性,在自然界中降解缓慢,若长期使用,会造成环境污染,残留的五氯酚钠还能通过食物链进入人体而富集[2]。微量的五氯酚钠即对人体有毒,可导致中枢神经系统、血液、肝、肾损伤及内分泌紊乱。五氯酚钠性质较稳定,易富集于沉淀物中,在动植物体内富集率高,可以通过人畜呼吸道、消化道、皮肤接触等进入机体。在体内五氯酚钠转变为五氯酚,五氯酚具有有机氯和酚的毒性,会对人畜产生急慢性毒害。美国环境保护署(EPA)已经将五氯酚钠列为可疑致癌物质,并限制其使用。中国农业部也已禁止在水生动物养殖中使用五氯酚钠。但目前仍有一些养殖户在水产养殖中非法使用五氯酚钠,在2010年农业部第一、二次产地水产品质量抽检中仍能检测出五氯酚钠。因此,研究五氯酚钠在淡水鱼体内药代动力学规律及残留的检测方法,将有助于进一步规范进而杜绝该药物在水产品养殖中的非法使用。
目前,国内外对五氯苯酚及其钠盐在土壤[3]、水体[4-5]、木材[6]、皮革[7]、纺织品[8]、蜂蜜[9]、尿[10]中残留的研究相对较多,而对其在动物组织中残留的研究较少,对五氯酚钠在水产动物体内的药代动力学规律及残留的研究尚未见报道。为此,本研究中,作者以鲫Carassius auratus为试验对象,研究了五氯酚钠在鲫体内的毒性及代谢动力学规律,旨在建立一种完整、准确的揭示五氯酚钠在水产动物体内药代动力学特征的方法。
1.1 材料
1.1.1 鲫 试验用鲫购自上海市松江区水产良种场,体质量为(22±2)g。试验前先在室内常规饲喂2周,然后挑选体表完整、健康活泼、无病无伤的个体用于毒性试验,为了确定药物浓度的大概范围,正式试验前先进行预试验。养殖场地为上海市水产研究所内的玻璃养殖池,养殖规模根据试验要求预先进行设计。试验用水为曝气7 d以上的自来水,相关水质指标符合渔业水质标准。
1.1.2 试验药品及仪器 试验药品有五氯苯酚标准品,质量分数为99.0%,购自Sigma公司;五氯酚钠原料药,质量分数为80%,购自上海富庶化工有限公司;正己烷为HPLC级;其他试剂均为市售分析纯。
试验仪器有PL202-S电子天平(METTLER)、MSI Minishaker型震荡器(IKA)、Eppendorf 5810R离心机、Agilent GC6890气相色谱仪(配63Ni微电子捕获检测器μECD)。
1.2 方法
1.2.1 毒性试验 挑选健康活泼、大小均匀的鲫70尾,分为7组,每组10尾,采用6个浓度梯度和1个对照进行预试验[11]。试验采用常温静水模式,时间为96 h,根据试验结果确定该种药物对试验鱼的最高安全浓度[12]。如果该浓度范围无法确定,则另选一个浓度范围进行试验,以确定试验所需的最高安全浓度。将试验药物配成母液,再按比例稀释成浓度为0(对照)、1、2、3、4、5、10 mg/L,将试验鱼从低浓度到高浓度逐个放入。试验期间不喂饵,将死亡的鱼及时捞出,并放入清水中,5 min不动为死亡。试验开始后,连续观察各浓度下试验鱼的异常行为、体表变化等,记录死亡和存活数量。
1.2.2 药代动力学试验 挑选健康活泼、大小均匀的鲫100尾用于试验。将试验鱼在药物浓度为2 mg/L的水溶液中浸浴24 h后,转入清水玻璃池中饲养,水温为(25±0.5)℃,pH为7.0～8.0。分别于药浴后的0、2、4、8、12 h和1、2、3、5、7、8、10、12、14、21、28、35、42、49、63、70 d随机取样3～5尾,从心脏取血,置于肝素化的离心管中,将血样与肌肉等组织均置于冰箱(-40℃)中保存,待测。
1.2.3 样品处理
1)血浆样品的处理。准确吸取100 μL样品,加入0.5 mL体积分数为50%的硫酸溶液中,涡旋1 min后,在80℃的水浴中温浴30 min,冷却至室温;加入1 mL正己烷,充分涡旋2 min,离心;取正己烷提取液于另一离心管中,重复提取一次,合并有机层。在正己烷提取液中加入2 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液,涡旋2 min,离心;吸取K2CO3溶液层于另一离心管中,再用2 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液提取一次,合并K2CO3提取液。将0.1 mL乙酸酐加入到上述K2CO3提取液中,涡旋2 min并不断放气,加1 mL正己烷提取两次,合并正己烷层,用1.0 g无水Na2SO4脱水,待测。
2)肌肉样品的处理。准确称取1.0 g样品于具塞试管中,加入8 mL体积分数为50%的硫酸溶液,涡旋1 min后,在80℃的水浴中温浴30 min,冷却至室温,加入10 mL正己烷,充分涡旋2 min,离心;取正己烷提取液于另一离心管中,重复提取一次,合并有机层。在正己烷提取液中加入4 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液,涡旋2 min,离心;吸取K2CO3溶液层于另一离心管中,再用4 mL 0.1 mol/mL的K2CO3溶液提取一次,合并K2CO3提取液。将0.2 mL乙酸酐加入到上述K2CO3提取液中,涡旋2 min并不断放气,加2.5 mL正己烷提取两次,合并正己烷层,定容至5.0 mL,用2.0 g无水Na2SO4脱水,待测。
1.2.4 标准曲线和回收率 准确称取20.20 mg五氯苯酚标准品,用0.1 mol/L K2CO3溶液溶解,定容至100 mL,浓度为200 μg/mL,于4℃下保存。将上述溶液稀释配制成0.03、1、2、5、10、50 ng/mL的标准溶液,各吸取1 mL,处理步骤同样品处理方法,进行气相色谱测定,绘制“色谱峰面积/五氯酚钠浓度”标准曲线。
取空白对照组鲫血浆100 μL,准确加入一定量的五氯酚钠溶液,配制成五氯酚钠浓度分别为2、20、100 ng/mL的血浆样品,按前述血样处理方法处理,用气相色谱测定。取空白对照组鲫肌肉1.0 g,准确加入一定量的五氯酚钠溶液,配制成五氯酚钠浓度分别为2、20、100 ng/mL的肌肉样品,按前述肌肉样品处理方法,用气相色谱测定。回收率为每个测得浓度占实际浓度的百分比。
1.2.5 色谱条件 色谱柱为DB-35MS(30 m× 0.25 mm×0.25 μm);进样口温度为250℃,检测器温度为300℃;柱温为140℃(保留2 min),以10℃/min的升温速度升至200℃(保留7 min),再升至260℃(保留3 min);载气为99.999%的高纯氦气,流量为1.2 mL/min,线速度为29 cm/s;尾吹气为99.999%的高纯氮气,流量为60.0 mL/min;进样量为1 μL,进样方式为不分流进样,吹扫放空时间为0.75 min。
2.1 标准曲线和回收率
按照本试验的方法,五氯苯酚在0.03～50 ng/mL范围内线性关系良好,用回归分析法对数据进行分析处理,以一定标准品溶液的浓度作为横坐标,相应的峰面积作为纵坐标,得标准曲线y= 144.2 x+193.5,r=0.9992。在本试验条件下,用气相色谱法测得五氯酚钠在鲫血浆和肌肉中的回收率分别为92.2%±4.15%、88.7%±6.32%。
2.2 毒性试验
五氯酚钠浓度为10 mg/L时,试验鱼刚放入药液中就表现出烦躁的特征,具体为快速游动,反应激烈,10 min即出现失去平衡现象,1 h后试验鱼100%死亡;当五氯酚钠浓度为3 mg/L时,1 h后试验鱼有10%死亡,2 h后试验鱼有40%死亡,8 h后试验鱼100%死亡;当五氯酚钠浓度为2 mg/L时,试验鱼健康存活,96 h时无死亡现象(表1)。试验结果表明,五氯酚钠可以很快被试验鱼吸收,对试验鱼的毒性作用非常迅速。
表1 五氯酚钠对鲫的毒性试验
Tab.1 Acute toxicity of sodium pentachlorophenol to crucian carp Carassius auratus
浓度/ (mg·L-1) concentration死亡率mortality/% 1 h2 h4 h8 h24 h48 h96 h 10100100100100100100100 5100100100100100100100 450100100100100100100 3104080100100100100 20000000 10000000 00000000
2.3 药代动力学
将试验鱼在浓度为2 mg/L的五氯酚钠水溶液中浸浴24 h后,于不同时间段采样,将样品处理后经气相色谱分析,药物在鲫血浆和肌肉中的药动学曲线如图1所示。药物在血浆中的动力学参数结果显示,五氯酚钠在鲫血浆中的血药浓度参数符合一室模型,其主要药动学参数Cmax、AUC0-t、Tmax、MRT0-t分别为12.0 ng/mL、943.3 ng/(mL·h)、1 h、264.7 h,药物迅速被鲫吸收,在0.5 h就能达到11.5 ng/mL,1 h达到峰值12.0 ng/mL,与毒性试验结果相符。但药物的代谢较慢,在药浴49 d后血浆中仍能检测到药物(浓度为0.033 ng/mL),直到70 d后才检测不到药物。
药物在鲫肌肉中的动力学参数结果显示,五氯酚钠在鲫肌肉中的药动学参数符合二室模型,其主要药动学参数t1/2α、t1/2β、MRT0-t、Tmax、Cmax、AUC0-t、MAT分别为12.6 h、186.8 h、260.4 h、1 h、11.84 ng/mL、1106.5 ng/(mL·h)、222.5 h,药物在肌肉中的分布与在血浆中类似,迅速被鲫吸收,1 h达到峰值11.84 ng/mL,比血浆中的峰浓度略低。药物在肌肉中的代谢比血浆中略慢,可能是由于血浆中的药物与血浆蛋白结合而使代谢加快。
图1 五氯酚钠在鲫体内的药动学曲线(mean±S.D.,n=3)
Fig.1 Pharmacokinetic profile of sodium pentachlorophenol in crucian carp Carassius auratus
五氯酚钠作为一种非选择性接触型除虫、除草、清塘药物,对鱼类的急性毒害作用较大。本试验结果表明,五氯酚钠浓度为3 mg/L时,8 h后试验鱼就100%死亡,远小于潘建林等[13]报道的克氏原螯虾对五氯酚钠的耐受力,与卢玲等[14]报道的五氯苯酚对剑尾鱼和稀有鲫的毒性试验相符;五氯酚钠对试验鱼的安全浓度为2 mg/L,96 h无死亡现象。在实际应用中,必须慎用五氯酚钠,以防止对鱼类造成危害,进而进入市场危害人民群众的身体健康。药代谢动力学的试验结果表明,五氯酚钠可被鲫迅速吸收,在血浆中的血药浓度参数符合一室模型,1 h后即可达到最高药物浓度(12.0 ng/mL),在肌肉中的药动参数符合二室模型,且达到峰值时间与血液基本一致,肌肉中药物峰浓度比血液中略低,推测可能是由于五氯酚钠在血液和肌肉中的交换速率不同,而交换速率与血流量有关,二者具有动态同步性。药物在血液和肌肉中的代谢都比较慢,给药70 d后在血液中才检测不到药物。与五氯酚钠在肌肉中的代谢相比,药物在血液中的代谢稍快。推测可能是由于药物进入血液后,部分药物与血浆蛋白结合成为结合型药物,部分药物呈游离型,经门静脉进入肝脏,经肝内药物代谢酶作用,使血浆中药物浓度迅速降低,从而使其在血液中的代谢加快。
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The acute toxicity and pharmacokinetics of sodium pentachlorophenate in crucian carp Carassius auratus
LI Lei,HUANG Qing-fa,XIAO Yu,SUN Jian-hua,QI Jun-yuan,SUN Zhen-zhong
(Shanghai Aquatic Products Quality Test&Supervision Station,Shanghai Fisheries Research Institute,Shanghai 200433,China)
Abstract：The acute toxicity of sodium pentachlorophenate(PCP-Na)to crucian carp Carassius auratus with body weight of(22±2)g were studied at various concentrations at water temperature of(25±0.5)℃using a laboratory test.The animals were all found to be died at the drug concentration of 10 mg/L after 1 h administration,PCP-Na showing strong acute toxicity.At the drug concentration of 2 mg/L,however,all the animals were survival and healthy after 96 h administration.The in vivo pharmacokinetics was investigated in the crucian carp bathed in PCP -Na.Promisingly,the drug was quickly absorbed by the animals,11.5 ng/mL PCP-Na was observed in the blood in 0.5 h administration and the peak concentration of 12.0 ng/mL after 1 h administration.The plasma concentration of PCP-Na was detected for up to 70 days and in very trace quantities,and thereafter no drug was found.The pharmacokinetics in the muscle was shown to be similar to that in the blood,the peak(11.84 ng/mL)in the muscle after 1 h administration,lower than that in the blood.It was found that the t1/2αwas 12.6 h,t1/2β186.8 h, MRT0-t260.4 h,Tmax1 h,Cmax11.84 ng/mL,AUC0-t1106.5 ng/(mL·h)and MAT 222.5 h in the muscle.
Key words：crucian carp Carassius auratus;sodium pentachlorophenate;acute toxicity;pharmacokinetics;gas chromatography
中图分类号：S948
文献标志码：A
文章编号：2095-1388(2012)03-0243-04
收稿日期：2011-07-28
作者简介：李磊(1982-),男,博士,工程师。E-mail:llsun2008@yahoo.com.cn