饲料中添加枯草芽孢杆菌对草鱼消化酶活性和肠道菌群的影响

摘要：研究了饲料中添加枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis对草鱼Ctenopharyngodon idellus消化道酶活性和肠道菌群数量的影响。选用体质量为(51.37±0.58)g的健康无病草鱼300尾,随机分为对照组和处理组两组,每组设3个重复,每个重复放50尾鱼,对照组饲喂基础日粮,处理组饲喂含枯草芽孢杆菌(108CFU/kg饲料)的基础日粮,日投喂量为鱼体质量的3%,饲养时间为45 d。结果表明:处理组肠道内容物中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性分别比对照组显著提高14.75%(P＜0.01)、13.03%(P＜0.01)和78.95%(P＜0.01);肝胰脏中脂肪酶和胰蛋白酶活性分别比对照组显著提高17.72%(P＜0.01)和13.81%(P＜0.01)。肠道菌群数量分析显示,与对照组相比,处理组肠道芽孢杆菌和假单胞菌数量极显著提高(P＜0.01),而致病性弧菌和大肠杆菌数量却极显著降低(P＜0.01)。研究表明,饲料中添加枯草芽孢杆菌能够改善草鱼肠道菌群组成,并提高消化道特定消化酶活性。

近年来,随着养殖规模的不断扩大,水产养殖环境日益恶化,严重影响了水产动物的生长性能和水产品的质量安全。益生菌因具有促进动物生长和改善水质等功能而被广泛应用于水产养殖业[1]。自Kozasa[2]首次将益生菌应用于水产养殖以来,越来越多的研究表明,益生菌应用于水产养殖业可产生以下效果[3-6]:①改善水生动物肠道的微生态环境,分泌消化酶,提高饲料转化率,预防疾病,促进生长;②降低水体中氨氮、亚硝酸盐和硫化氢等的含量,改善养殖水质。目前,应用于水产上的益生菌制剂主要有硝化细菌、光合细菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、乳酸菌、酵母菌、链球菌和EM微生物菌群等。与其它菌株相比,芽孢杆菌具有抗逆性强、耐高温和高压、易贮存、产酶丰富[7]、抑制病原菌繁殖、促进动物营养的消化吸收、分解有机污染物和净化水质[8-10]等优点,其抗菌谱广泛,可产生多种酶类和多糖[11],促进水产动物的生长,提高水产动物的免疫力。大量研究表明,芽孢杆菌在提高水产动物消化酶活性,促进生长,优化鱼体内和养殖水体的微生态结构,以及净化养殖水质等方面具有较好的效果[12-14]。中国的草鱼养殖规模巨大,面临的问题也较多,枯草芽孢杆菌作为一种优良的饲料添加剂在草鱼养殖中的应用前景较为广泛。但目前对枯草芽孢杆菌在草鱼养殖中的应用研究较少。本试验中,作者以在实验室分离筛选出的一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis作为益生菌添加到饲料中,研究其对草鱼Ctenopharyngodon idellus消化酶活性和肠道菌群的影响,旨在为该益生菌在草鱼养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

草鱼由浙江省绍兴市水产技术推广站提供,体质量为(51.37±0.58)g。

EMB、TSA、MYP、MRS和TCBS培养基均购自杭州天和微生物试剂厂,PSE培养基购自Oxoid公司。

试验饲料由浙江一星饲料集团按试验要求加工制得,基础日粮(干质量)配方(质量分数,%):鱼粉1、大豆粉5、棉籽粕23、菜籽粕27.2、小麦面粉18、米糠8、酒糟粉6、麦芽根6、预混料5、添加剂1,其中预混料为每千克饲料中包括VA 150 000 IU、VD330 000 IU、VE 750 mg、VK3150 mg、Fe 2.5 g、Cu 0.075 g、Zn 0.75 g、Mn 0.5 g、Mg 5 g、I 22.5 mg、Se 3.5 mg、Co 7.5 mg。饲料营养水平(湿质量):水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、钙、总磷分别为9.31%、28.40%、2.97%、12.08%、0.80%、1.29%(均为质量分数)。

枯草芽孢杆菌菌种由浙江大学动物科学学院饲料科学研究所微生物与基因工程实验室从土壤中分离培养得到,枯草芽孢杆菌制剂(菌含量均为108CFU/g)由本实验室制备。

1.2.1 预试验用含不同浓度的芽孢杆菌饲料(0.5×108、1×108、10×108CFU/kg)分别饲喂草鱼,测定20 d后的鱼体质量,选取鱼体增重最大组的芽孢杆菌浓度为试验浓度。本试验中选取芽孢杆菌浓度为108CFU/kg(饲料)为添加量。

1.2.2 试验动物分组与饲养管理试验在浙江绍兴县水产技术推广站水产养殖基地进行。先用体积分数为0.1%的KMnO4溶液将草鱼浸泡消毒后,暂养5 d。选取体质量为(51.37±0.58)g的健康无病草鱼300尾,随机分成两组:对照组和处理组,每组设3个重复,每个重复放50尾鱼。预试验期为7 d,正式试验期为45 d,对照组饲喂基础日粮,处理组饲喂含芽孢杆菌制剂(1 g/kg饲料)的基础日粮。试验草鱼在室内过滤式循环水系统的圆形水族箱(体积为2.75 m3)中饲养,实际水体体积为1.33 m3,试验水温为18～25℃,用ACO-318型空气压缩机24 h增氧。投饲严格按照“四定”,即定时、定量、定质、定点的原则进行,每天8:00、12:00和19:00投饲,日投饲量为草鱼体质量的3%。每天观察鱼的健康状况并记录水温、投饲量和鱼死亡情况。每周取水样用于测定养殖水体的水质指标,每次取完水样后换水1/3,水源为充分曝气的水库水,试验期间不清除残料和粪便。

1.2.3 样品的采集草鱼经45 d养殖后停食24 h,从每个重复中随机抽取10尾鱼,用0.2 g/L的MS-222将鱼麻醉后,在冰块上进行解剖,清洗消化道和肝胰脏,移出,用冰冷蒸馏水充分冲洗外表。结扎消化道的前端,取肠道内容物置于无菌离心管中,一部分于4℃下保存,在24 h内用于分析微生物菌群数量;另一部分于-80℃下保存,用于肠道消化酶活性的测定。另取出肝胰脏于-80℃保存,用于肝胰脏消化酶活性的测定。

1.2.4 样品的制备样品解冻后,取一定量的肠内容物和肝胰脏以1∶9(质量比)的比例加入4℃预冷的灭菌生理盐水,先在冰浴中用自动匀浆器匀浆6 min,随后在4℃下以4 000 r/min离心30 min,取上清液测定酶活指标。

1.2.5 消化酶活性的测定肠道及肝胰脏中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的测定均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒,并按其说明书进行操作。重复测定3次。

1.2.6 肠道特定菌群数量的测定本试验中所用的选择性培养基见表1。

表1 草鱼肠道中特定细菌的选择性培养基、培养条件和稀释倍数
Tab.1 The selective medium,culture conditions and dilution ratio for intestinal microflora in grass carp

dilution ratio胰蛋白胨大豆琼脂TSA总可培养细菌total bacteria需氧,30℃,24 h104,105,10培养基名称culture medium培养菌种culture objects培养条件culture conditions稀释倍数6乳酸菌培养基MRS乳酸菌lactic acid bacteria需氧,30℃,18 h102,103,104甘露糖蛋卵黄多粘菌素琼脂MYP芽孢杆菌Bacillus sp.需氧,30℃,24 h101,102,103伊红美蓝琼脂EMB大肠杆菌Escherichia coli需氧,30℃,24 h103,104,105假单胞菌选择性培养基PSE假单胞菌Pseudomonas sp.需氧,30℃,24 h104,105,106弧菌选择性培养基TCBS致病性弧菌Vibrio sp.需氧,30℃,24 h104,105,106

在无菌条件下,取肠道内容物0.1 g放入1.5 mL离心管中,加入0.9 mL体积分数为0.85%的生理盐水,充分混匀,制成10倍稀释液。然后再取0.1 mL该液与0.9 mL无菌生理盐水充分混匀,此为102倍稀释液。之后依次进行103～106倍比稀释。肠道内容物中的细菌总数、大肠杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌、气单胞菌、弧菌、假单胞菌的数量不同,根据具体情况进行稀释。肠道内容物选取3个稀释梯度,分别取100 μL稀释液以平板涂布法接种于相对应的选择性培养基上,然后进行菌落计数。重复测定3次。计算每克肠道内容物的菌数,结果以对数值(lg CFU/g)表示。

利用Excel软件对试验数据进行处理,试验数据均用平均数±标准差(mean±S.D.)表示;采用SPSS 16.0软件对试验数据进行单因素方差分析及多重比较。

2 结果

从表2可见:处理组草鱼肠道内容物中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性分别比对照组显著提高14.75%(P＜0.01)、13.03%(P＜0.01)和78.95%(P＜0.01);肝胰脏中脂肪酶和胰蛋白酶活性分别比对照组显著提高17.72%(P＜0.01)和13.81%(P＜0.01),但淀粉酶活性却显著降低15.55%(P＜0.05)。

表2 饲料中添加枯草芽孢杆菌对草鱼消化酶活性的影响
Tab.2 Effect of dietary Bacillus subtilis on digestive enzyme activities in grass carp

注:*表示与对照组差异显著(P＜0.05);**表示与对照组差异极显著(P＜0.01)。
Note:*means significant difference compared with the control(P＜0.05);**means very significant difference compared with the control(P＜0.01).

项目item组别group胰蛋白酶trypsin/(U·mg-1)淀粉酶amylase/(U·g-1)脂肪酶lipase/(μmol·g-1)肠道内容物intestinal contents肝胰脏hepatopancreas对照组control group处理组treatment group对照组control group处理组treatment group 1349.42±48.96 1548.45±49.95**2185.54±79.83 2487.33±41.59**0.19±0.02 0.34±0.033**48.80±2.45 41.21±4.16*137.10±4.91 154.96±4.72**129.75±9.03 152.74±11.28**

从表3可见:与对照组相比,处理组草鱼肠道的乳酸菌数量显著降低(P＜0.05),致病性弧菌和大肠杆菌数量极显著降低(P＜0.01),但芽孢杆菌和假单胞菌数量却极显著提高(P＜0.01)。

表3 饲料中添加枯草芽孢杆菌对草鱼消化道微生物菌群数量的影响
Tab.3 Effect of dietary Bacillus subtilis on intestinal microflora in grass carplg CFU/g

sp.对照组control处理组treatment组别group总可培养细菌total bacteria乳酸菌lactic acid bacteria芽孢杆菌Bacillus sp.致病性弧菌Vibrio sp.大肠杆菌Escherichia coli假单胞菌Pseudomonas 7.99±0.78 8.00±0.91 6.40±0.11 6.23±0.10*2.51±0.15 3.10±0.19**7.18±0.16 5.96±0.55**7.80±0.25 6.69±0.34**6.96±0.14 7.47±0.16**

3 讨论

草鱼消化道中消化酶活性的变化可以反映草鱼对饲料消化利用能力的高低,因此可以将其作为营养状态指标来指导草鱼的养殖,改善饲养效果[15]。Rodulf[16]和Zhao[17]研究表明,草鱼淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性受多种因素影响,其中包括饲料组成。大量研究结果表明,益生菌剂可明显提高鱼类蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性[18-20],有利于促进养分降解和消化吸收,从而促进鱼类生长。Sögarrd等[7]首次发现益生菌可提高动物消化酶活性;温茹淑等[21]研究表明,饲料中添加1%复合微生物制剂(主要是芽孢杆菌和酵母菌等)可显著增加草鱼肝胰脏及肠道中淀粉酶和脂肪酶的活性;刘波等[22]发现,在饲料中添加200 mg/kg和300 mg/kg地衣芽孢杆菌均可显著提高食糜中蛋白酶和淀粉酶活性及肠道内蛋白酶活性,降低饲料系数;刘小刚等[23]在异育银鲫饲料中添加不同浓度的芽孢杆菌制剂,结果发现添加0.2%的芽孢杆菌制剂组鱼体肠道和肝胰脏中蛋白酶活性分别比对照组提高466.2%和85.4%,而添加0.1%的芽孢杆菌制剂组鱼体肠道和肝胰脏中淀粉酶活性分别比对照组提高83.7%和129.5%。本试验结果表明,饲料中添加枯草芽孢杆菌可以显著提高草鱼肠道和肝胰脏中胰蛋白酶、脂肪酶以及肠道中淀粉酶活性,从而有助于草鱼对饲料的消化吸收,并促进草鱼生长,处理组草鱼的特定生长率比对照组提高了16.67%(P＜0.05)(对草鱼的促生长试验结果另文发表)。本试验结果与上述研究结果一致。芽孢杆菌能增加草鱼机体消化酶活性的机理主要与芽孢杆菌在肠道内能分泌多种酶类进入宿主肠道的“酶池”中,从而提高宿主肠道消化酶活性有关[24-25]。

倪寿文等[26]认为,草鱼消化道内的淀粉酶主要是由散布于肝脏内的胰腺组织分泌的。本试验中,处理组肠道内的淀粉酶活性高于对照组,而肝胰脏中淀粉酶活性却低于对照组。这可能是因为处理组肠道内的芽孢杆菌菌体自身分泌淀粉酶,从而增加了鱼体肠道内的淀粉酶活性。

肠道菌群对鱼虾类的生长、生存有着重要的生理意义[27-28]。芽孢杆菌作为饲料添加剂对鱼类和其它水生动物的促生长作用已有大量报道[29-30];陈勇等[31]和许禔森[32]的研究均表明,饲料中添加益生菌可减少鲤肠道大肠杆菌和草鱼肠道弧菌等有害菌数量;刘波等[33]发现,日粮中添加地衣芽孢杆菌可使异育银鲫肠道内芽孢杆菌和乳酸杆菌数量大大增加,大肠杆菌数量显著降低;沈锦玉等[34]在饲料中添加枯草芽孢杆菌B115,可显著提高翘嘴红鲌、银鲫、日本沼虾的肠道消化酶活性,同时能增加肠道中有益菌群(如乳杆菌和双歧杆菌)的数量;宋理平等[35]的研究表明,饲料中添加芽孢杆菌可显著降低宝石鲈肠道有害菌(气单胞菌、肠杆菌、黄杆菌)数量。本试验结果表明,饲料中添加枯草芽孢杆菌可以明显增加草鱼肠道芽孢杆菌数量,同时减少大肠杆菌和弧菌数量,这与大多数试验结果一致。但处理组肠道乳酸菌数量较对照组有所减少,与上述研究结果有所差异,其原因有待进一步研究。大量研究表明,饲用芽孢杆菌能促进养殖动物肠道有益菌群增殖,并产生蛋白类拮抗物质,拮抗肠道病原细菌[36-39],其与有害菌竞争肠道黏附位点,形成优势菌群,该优势菌群具有维持和调整肠道微生态平衡作用。饲料中添加芽孢杆菌优化肠道菌群组成的机理:首先,芽孢杆菌通过与致病菌竞争生存空间、定居部位以及营养物质等,有效地抑制有害菌的生长和繁殖,从而改善肠道微生物菌群组成;其次,芽孢杆菌通过产生酸性物质(如挥发性脂肪酸)、细菌素等物质[40-41],抑制或杀灭有害菌,从而调整肠道微生态平衡。

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Effects of dietary Bacillus subtilis on digestive enzyme activity and intestinal microflora in grass carp Ctenopharyngodon idellus

LI Wei-fen,SHEN Tao,CHEN Nan-nan,DENG Bin,FU Luo-qin,ZHOU Xu-xia
(Institute of Feed Science,College of Animal Science,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China)

Abstract：A feeding trial was performanced at water temperature of 18-25℃to investigate the effects of dietary bacterium Bacillus subtilis on digestive enzyme activity and intestinal microflora in grass carp Ctenopharyngodon idellus with initial body weight of 51.37 g±0.58 g.Three hundred individuals of grass carp were randomly divided into two treatments with three replicate tanks at a rate of 50 fish per tank,and fed the basal diet in the control group,and the basal diet supplemented with bacterium Bacillus subtilis in the treatment groups three times a day at 8:00 hour,12:00 hour and 19:00 hour at a feeding rate of about 3%for 45 days.There were very significantly 14.75%higher trypsin,13.03%higher lipase and 78.95%higher amylase activities in the intestinal chyme in the fish fed the diets containing Bacillus subtilis(P＜0.01)compared with those in the control group.The fish fed the diets containing Bacillus subtilis had 17.72%higher lipase and 13.81%higher trypsin activities in hepatopancreas (P＜0.01).There was significantly higher number of Bacillus sp.and Pseudomonas sp.in the intestine in the treated groups(P＜0.01),while there was significantly lower number of E.coli and Vibrios than that in the control group(P＜0.01),indicating that supplementation of Bacillus subtilis in diets led to increase in the digestive enzyme activities and improvement of the intestinal microflora in grass carp.

Key words：Bacillus subtilis;Ctenopharyngodon idellus;digestive enzyme activity;intestinal microflora

作者简介：李卫芬(1965-),女,研究员,博士。E-mail:wfli@zju.edu.cn

通信作者：周绪霞(1980-),女,助理研究员,博士。E-mail:xuxiazhou@yahoo.com