乌拉坦对鲫的麻醉效果

摘要：在鲫Carassius auratus适宜生存温度(室温为15～25℃)条件下,研究了10、20、30、40、50 g/L的乌拉坦(Urethane)溶液(pH为7.0±0.44)对鲫(体质量为230 g±9.46 g)的麻醉效果,探讨了乌拉坦对水生动物的麻醉作用,并提供日常实用的麻醉参数。结果表明:乌拉坦浓度为10～50 g/L时,麻醉时间随着乌拉坦浓度的增大而缩短,复苏时间随着乌拉坦浓度的增大而延长,但浓度为50 g/L时与浓度为40 g/L时相比,鲫的复苏时间无显著性差异(P＞0.05);浓度为10～40 g/L时,各组鲫的复苏率均为100%,浓度为50 g/L时,鲫的复苏率为88%;浓度为10～50 g/L时,各组鲫7 d的存活率均为100%。鲫在不同浓度(10～50 g/L)的乌拉坦溶液中药浴一定时间后,将其暴露于空气中,经过一定时间后鲫可自动苏醒而弹起。其中除50 g/L浓度组与40 g/L浓度组之间,鲫的弹起时间无显著差异(P＞0.05)外,其余浓度组之间鲫的弹起时间均有显著差异(P＜0.05);各浓度组药浴时间为10 min与5 min之间,鲫的弹起时间无显著差异(P＞0.05),10 g/L组的药浴时间为25 min与20 min之间,鲫的弹起时间无显著差异(P＞0.05),各浓度组其余药浴时间之间均有显著差异(P＜0.05)。各试验组鲫7日存活率均为100%。药浴后的鲫能够恢复正常行为状态,表明乌拉坦对鲫行为的影响无明显的后遗效应。综合各项试验结果,表明乌拉坦对鲫的麻醉安全浓度为40 g/L。

关键词：乌拉坦;鲫;麻醉时间;复苏时间;弹起时间;复苏率;7日存活率

目前,麻醉剂已广泛应用于鱼类的研究和生产中。麻醉剂可以大大减少鱼体因应激反应而带来的身体损伤[1],还可方便鱼体的测量、标记、抽血等试验操作[2-4]。

国际上用于水生动物的麻醉剂近30种,包括Tricaine methanesulfonate(MS-222,化学名为3-氨基苯甲酸乙酯,化学式为C10H15NO5S)、Eugenol (FA-100,丁香酚,化学式为C10H12O2)、CO2等,其中最常用的是MS-222。但MS-222也有一些缺点,如MS-222溶液为酸性,对鱼体深度麻醉后进行操作时,鱼血浆中皮质醇的含量还在增加[5];运输时MS-222不能降低鱼类CO2的排放量[6];其溶液还要避免阳光直射,否则会对海水鱼有较强的毒性[7]。此外,MS-222价格较昂贵,因此对其推广使用受到一定限制。FA-100是近年来国际上比较关注且应用越来越多的水产麻醉剂,但FA-100也有一些不足。如FA-100溶液具有挥发性,在麻醉过程中药效会逐渐下降,甚至麻醉后进行离水操作时,鱼体还有复苏挣扎的现象;同时还会产生明显的气味,对周围环境和人体有一定的影响。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)也认为,丁香酚并非通常想象的那样安全[8]。

乌拉坦(Urethane,化学名称为氨基甲酸乙酯,化学分子式为H2NCOOC2H5),在医学上曾作为镇静剂和催眠药[9],是动物常用的一种麻醉剂,其麻醉效果稳定,安全度高[10],在国内外广泛用于急性动物试验中。在生物医学试验中,常用于家兔和大鼠等陆生动物的麻醉。Soldatov[11]曾研究过用乌拉坦麻醉海水鱼对其生理的影响。20世纪90年代初,在渔业生产中就开始使用乌拉坦,如用1～4 g/L的乌拉坦水溶液,可使亲鱼麻醉[12]。在观赏鱼的繁殖中也使用过乌拉坦,如采用0.8 mg/L的乌拉坦麻醉银龙鱼,待其处于半麻醉状态时,可进行催产药物注射[13]。在鳜的运输中也使用过乌拉坦,到达目的地后,将鱼放入清水中,不久即可

恢复正常[14]。从已有的研究结果看,使用乌拉坦溶液作为鱼类的麻醉剂,对其使用浓度没有一个统一的标准,并且缺乏对其麻醉时间和麻醉效果的系统研究,而国内外也未见有专门针对乌拉坦对鱼类麻醉试验的研究报道。为此,本试验中,作者以鲫Carassius auratus为研究对象,在室内温度为15～25℃条件下,采用药物溶液浸浴的方法研究了乌拉坦溶液对鲫的麻醉效果,并对鲫的麻醉过程和复苏过程进行了分期,以期为鱼类的急性试验寻求一种有效、迅速、价廉、易得的水产动物麻醉剂,并为其在水产实践中的应用提供适宜的麻醉参数。

1 材料与方法

1.1.1 试验鲫从秦皇岛水产市场购买健康鲫共360尾,体质量为(230±9.46)g,体长为(21± 0.96)cm,雌雄不限,暂养于燕山大学国防重点学科实验室水池中,使其适应性生活3 d。试验期间,室温为15～25℃,pH为7.0±0.44,试验前停止投喂24 h。

1.1.2 试验药品质量分数为20%的乌拉坦试剂由广州高诚化学试剂厂生产。

1.2.1 麻醉剂药液的配制根据预试验结果,用自来水将乌拉坦分别配成浓度为0、10、20、30、40、50 g/L的药液,备用。

1.2.2 鲫麻醉时间、复苏时间和复苏率的测定将60尾鲫随机等分为6组,每组10尾。分别将鲫放入上述各浓度梯度的乌拉坦溶液中,记录其麻醉时间、复苏时间和复苏率。麻醉时间是指鱼被放进麻醉剂溶液中至鱼体失去平衡的时间;复苏时间是指将麻醉鱼放入清水后至鱼体翻正反射恢复的时间;复苏率(recovery rate)是指复苏鱼的数量占麻醉鱼总数的百分比。

麻醉试验在体积为30 L的塑料盆中进行,用秒表记录各组鲫在麻醉过程中各种生物行为特征出现的时间。

将麻醉处理后的鱼转入清水(pH为7.0± 0.44)中进行复苏试验。复苏试验在体积为4 m×5 m×0.5 m的试验水池中进行,用秒表记录各组鲫复苏过程中各种生物行为特征出现的时间,并计算各组鲫的复苏率(RR):

1.2.3 鲫7日存活率的测定鲫复苏试验后,使用增氧泵连续充气供氧,观察培养7 d,并计算各组鲫的7日存活率:

其中:R7d为试验鱼的7日存活率;St为试验鱼麻醉复苏时存活的数量;Sd为试验鱼麻醉复苏后未能存活7 d的数量。

1.2.4 乌拉坦麻醉剂对鲫弹起时间的影响试验将300尾鲫随机分为30组,每组10尾。将鲫分别放入浓度为10、20、30、40、50 g/L的乌拉坦溶液中,以不放麻醉剂的清水作为对照组。将各组鲫分别药浴5、10、15、20、25 min后暴露在空气中,记录鲫的弹起时间,观察药液浓度和药浴时间对鲫弹起时间的影响。弹起时间是指麻醉鱼暴露在空气中至自动弹跳的时间。将暴露在空气中弹起的鲫放回清水试验水池(4 m×5 m×0.5 m)中,用增氧泵连续充气,观察7 d,计算各组鲫的7日存活率。

试验结果均以平均值±标准差表示,采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析,再应用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

在乌拉坦麻醉剂的作用下,鲫在麻醉时期和复苏时期表现出多种生物行为特征(表1)。根据其主要的生物行为特征,为了便于表述和分析,本研究中制订了麻醉剂对鲫麻醉效果简洁实用并易于掌握的判定方法和分期标准,将麻醉过程分为3个时期,将复苏过程也分为3个时期(表1)。

麻醉时间是以将鱼放入麻醉溶液起至鱼进入A3麻醉期状态的时间来表示(表1)。将鲫放入不同浓度乌拉坦溶液中后鱼的麻醉时间各有差异(表2)。从表2可见:乌拉坦溶液浓度为10 g/L时,麻醉时间为(21.24±3.43)min;浓度为20 g/L时,麻醉时间明显缩短为(6.25±2.14)min (P＜0.01),可见,浓度为20 g/L时,可使鲫较快地进入麻醉状态;浓度逐步增大到50 g/L时,麻

醉时间也缩短为(2.02±0.88)min(P＜0.05)。结果表明,麻醉时间随着乌拉坦溶液浓度的增大而缩短,但浓度为50 g/L组与40 g/L组相比,麻醉时间无显著差异(P＞0.05)。

表1 麻醉时期和复苏时期的生物行为特征
Tab.1 Behavior characteristics of the fish in the anesthesia stages and recovery stages

时期Stages符号Sign生物行为特征Biologic behavior characteristics 1期Stage 1A1兴奋性略有降低,鳃盖扇动减慢减弱,鱼鳍摆动减慢减弱,翻正反射略有减弱,直立不稳时而沉浮麻醉期Anesthesia stages 2期Stage 2A2兴奋性明显降低,鳃盖扇动时有出现,鱼鳍时有摆动,翻正反射时有出现,侧翻水中3期Stage 3A3兴奋性基本消失,鳃盖扇动偶有出现,鱼鳍偶有摆动,翻正反射基本消失,侧卧水底死亡期Death stageD兴奋性消失,鳃盖扇动停止,鱼鳍摆动停止,翻正反射消失,侧卧水底,放回清水不可复苏1期Stage 1R1兴奋性略有恢复,鳃盖扇动偶有出现,鱼鳍偶有摆动,翻正反射略有恢复,侧卧水底复苏期Recovery stages 2期Stage 2R2兴奋性明显恢复,鳃盖扇动时有出现,鱼鳍时有摆动,翻正反射时有出现,侧翻水中兴奋性基本恢复,鳃盖扇动加快加强,鱼鳍摆动加快加强,翻正反射基本恢复,直立不稳时而沉浮正常期Normal stageN 3期Stage 3R3各种生物行为均恢复正常状态

表2 不同浓度乌拉坦溶液对鲫的麻醉效果(¯x±s,n=60)
Tab.2 The anaesthetic effects of Urethane at different concentrations on crucian carp Carassius auratus

注:同列中标有不同小写字母者表示组间差异显著(P＜0.05),标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P＞0.05)。
Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters within the same column are not significant differences.

药液浓度/(g·L-1) Medicine dose 7日存活率/% 7 day survival rate 0(对照)麻醉时间/min Anesthesia time复苏时间/min Recovery time复苏率/% Recovery rate 88100 100 1021.24±3.43a2.85±1.12d100100 206.25±2.14b4.21±1.45c100100 304.12±1.79c5.05±1.97b100100 402.22±0.92d6.01±2.16a100100 502.02±0.88d6.23±2.06a0 0 0

复苏时间是以将麻醉鱼放回清水中至鱼出现R3复苏期状态时的时间来表示(表1)。将各处理组鲫放回清水中的复苏时间也各有差异(表2)。从表2可见:乌拉坦溶液浓度为10 g/L时,鲫的复苏时间为(2.85±1.12)min;浓度逐步增大到50 g/L时,鲫的复苏时间也延长到(6.23±2.06) min(P＜0.05)。结果表明,鲫的复苏时间随着乌拉坦溶液浓度的增大而延长,但50 g/L组与40 g/L组相比,鲫的复苏时间无显著差异(P＞0.05)。

从表2还可见:乌拉坦浓度为10～40 g/L时,各组鲫的复苏率均为100%;浓度为50 g/L时,复苏率下降至88%。

本试验结果表明(表2):各试验组的7日存活率均为100%,与对照组相比,各试验组的7日存活率无明显差别(P＞0.05)。将复苏后的鲫放回清水中喂养7 d,鱼体的生物行为能够完全恢复正常状态,且未见生物行为异常的现象,表明乌拉坦麻醉剂对鲫的生物行为的影响无显著的较长时间的后遗效应。

鲫经不同浓度乌拉坦溶液药浴一定时间后,将其暴露于空气中,经过一定时间后鲫可自动苏醒而弹起。结果显示:随着药浴浓度的增加,鲫的弹起时间延长;随着药浴时间的延长,鲫的弹起时间也在延长;但在20 g/L组药浴25 min、30 g/L组药浴25 min、40 g/L组药浴20 min后、50 g/L组药

浴10 min后,鲫不能再自动苏醒而弹起(表3)。将复苏的鲫放回清水中喂养7 d,各组鲫的7日存活率均为100%。

表3 用不同浓度乌拉坦溶液药浴后的鲫暴露于空气中的弹起时间(¯x±s,n=300)
Tab.3 The bounce time of crucian carp Carassius auratus in air after immersing in Urethane

注:同列数据的右上角小写字母不同表示差异显著(P＜0.05),小写字母相同表示差异不显著(P＞0.05);同行数据的右上角大写字母不同表示差异显著(P＜0.05),大写字母相同表示差异不显著(P＞0.05);-表示鲫没有进入A3麻醉期状态;×表示鲫在空气中不能自动弹起。
Note:The means followed by different small letters in the same columns indicate significaat differences(P＜0.05).The means followed by the same small letters indicate no significant difference(P＞0.05);The different capital letters on the upper right corner on the data in the same lines indicate significaat differences(P＜0.05).The same capital letters indicate no significant difference(P＞0.05);-shows that Carassius auratus are not in anesthesia stage 3;×indicates that C.auratus cannot automatically wake up in the air.

药液浓度/(g·L-1) Medicine dose药浴时间Drug bath time/min 10152025 0(对照) 5 -----10---3.94±1.07dA4.12±1.04dA205.01±1.12cC5.46±1.22cC6.53±1.94cB7.97±2.11bA× 305.97±1.15bC6.22±1.24bC7.74±2.06bB8.94±2.12aA× 407.96±1.98aB8.44±2.25aB9.92±2.53aA×× 508.02±2.03a××××

3 讨论

乌拉坦麻醉剂多用于陆生动物,对动物的肌肉松弛效果较好,作用温和,可作深度麻醉,适用于作为呼吸系统兴奋药物等麻醉动物的研究。乌拉坦对动物通气量的影响较小,在研究呼吸兴奋药时为最佳选择[15]。乌拉坦尤其适用于家兔及大鼠等陆生动物,因此国际上一直将其作为陆生动物最常用的麻醉剂之一。

与其它麻醉剂相比,乌拉坦价格低廉、易获得、配制方便,加之其具有麻醉效果稳定、维持时间长、对家兔呼吸无明显抑制、安全度高、适宜学生操作等特点,已成为生物医学动物试验中常用的麻醉剂[9]。

乌拉坦是氨基甲酸酯类药,与胆碱酯酶结合形成氨甲酰化胆碱酯酶,由于水解速率比乙酰化胆碱酯酶慢,遂使其暂时失去水解乙酰胆碱的活性。乌拉坦通过抑制动物体内乙酰胆碱酶的活性,造成乙酰胆碱的积累,影响其神经传导而起到麻醉作用[16]。乌拉坦的麻醉效果比较稳定且安全度高,所以可以用于动物试验中,但同时它又能使心血管中枢受到抑制以及在动物体内不断蓄积,故长期以来主要用于急性动物试验中[16]。

与目前水产上常用的麻醉剂MS-222[5-8]和丁香酚[9]相比,乌拉坦具有无刺激性气味且易溶于水、配制方便、无挥发性、无需避光、麻醉效果比较稳定、维持时间较长、对水生动物呼吸抑制的作用较弱等优点。超过90%的氨基甲酸乙酯可被分解为乙醇、氨和碳水化合物等(这种代谢途径是无毒性的)[17],所以,乌拉坦的毒性作用较低。由于乌拉坦在淡水和海水中均具有良好的溶解性,且能够同时满足安全性、高效性、低成本和易获得的应用要求,所以适合作为水产麻醉剂使用。

虞藜等[16]也曾以乌拉坦作为麻醉剂进行鲫M细胞电生理特性的试验,结果表明,鲫的M细胞内动作电位与使用MS-222为麻醉剂的鲫无明显区别,因此,在研究M细胞电生理试验中可以用乌拉坦替代MS-222。结合本试验结果,作者认为,在急性试验中,一般情况下可以用乌拉坦替代MS -222和丁香酚。

本试验结果表明(表2):乌拉坦对鲫具有良好的麻醉作用,麻醉时间明显受浓度的影响,即随着浓度的增大,麻醉时间呈递减趋势,且不同浓度对麻醉时间的影响存在显著性差异。浓度为10 g/L时,麻醉时间为(21.24±3.43)min;浓度为20 g/L时,麻醉时间明显缩短为(6.25±2.14) min,可使鱼体较快达到麻醉效果;浓度增大到50 g/L时,麻醉时间也逐步缩短到(2.02±0.88) min,说明麻醉时间随着浓度的增大而缩短。但50 g/L组与40 g/L组相比,麻醉时间无显著差异,

可能再增加浓度也不会明显缩短麻醉时间,由此认为,20～40 g/L可能是乌拉坦有效而快速麻醉鲫的适宜浓度范围。本试验中鲫体质量为(230± 9.46)g,而虞藜等[13]用乌拉坦作为麻醉剂进行鲫M细胞试验时,鲫体质量为50～80 g,故本试验中用于麻醉所需的乌拉坦浓度较之为大。此外,虞藜等[16]没有报道乌拉坦的适宜麻醉浓度和离水操作时间。

依据不同浓度乌拉坦溶液对鲫复苏时间影响的结果看(表2),浓度为10～50 g/L时,鲫的最短复苏时间为(2.85±1.12)min,最长复苏时间为(6.23±2.06)min,即复苏时间随着浓度的增大呈递增趋势。但50 g/L组与40 g/L组相比,复苏时间无显著差异,复苏时间并没有显著延长。由此推测,可能再增加浓度也不会明显延长复苏时间,故乌拉坦适合用于水产动物的急性试验。

乌拉坦浓度为10～40 g/L时,各组鲫的复苏率均为100%;但浓度为50 g/L时,复苏率下降至88%(表2)。这表明乌拉坦浓度为10～40 g/L时,麻醉鲫是安全的,乌拉坦浓度达到50 g/L时就可导致部分鲫死亡,说明麻醉浓度超过了安全界限。由此认为,乌拉坦有效而快速麻醉鲫的安全麻醉浓度界限可能为40 g/L,超过此浓度就有可能导致部分鲫死亡。

对复苏鲫放回清水中观察7 d,结果各试验组鲫的7日存活率均为100%,与对照组相比无显著差异(表2),鱼的生物行为均能够从麻醉状态中完全恢复。只要麻醉鲫能够苏醒,就可以存活7 d。将复苏的鲫在清水中暂养7 d,且未见行为异常。说明乌拉坦对鲫生物行为的影响无后遗效应,表明10～40 g/L的乌拉坦为鲫安全有效的麻醉浓度。

鲫经乌拉坦溶液药浴后,将其暴露于空气中,经一定时间后会自动苏醒而弹起,且随着药液浓度的增加和药浴时间的延长,鲫弹起时间也延长,但在20 g/L组药浴25 min、30 g/L组药浴25 min、40 g/L组药浴20 min后、50 g/L组药浴10 min后,鲫不能自动苏醒而弹起(表3)。将复苏的鲫放回清水中,各试验组鲫的7日存活率均为100%,鱼体能够恢复至麻醉前的正常生物行为状态,乌拉坦可能在鱼体内能够快速分解或排泄,故对鲫无明显的毒性作用及后遗效应。由此认为,应用乌拉坦麻醉鱼体短时离水操作是可行的,乌拉坦可作为一种比较安全、有效、可靠的水产麻醉剂使用。

经乌拉坦溶液药浴的鲫暴露于空气中,经过一定时间会自动苏醒而弹起,说明乌拉坦在鲫体内会被逐渐代谢或在体内进行二次分布而失去麻醉作用,弹起时间能够代表麻醉剂的作用时间,可反映鱼体离水操作的时限,即离水操作时间。但随着麻醉浓度的增大和药浴时间的延长,鲫在空气中不能苏醒而弹起,可能是因药物浓度过高或药液浸泡时间过长使鱼体短时间内难以完全代谢分解或排泄。

如果药浴时间过长,鱼体可发生休克甚至死亡。将其暴露于空气中,鱼体几乎不能复苏而弹起;将鱼放回清水中,多数鱼体不能复苏;但若用清水冲洗鱼鳃,部分鱼体能够复苏。复苏时间不仅与麻醉剂的浓度有关,还与药浴时间和复苏方法甚至生活环境都有关。

麻醉效果受到鱼的种类、体质量、成熟度、机体状况、摄食活动等自身因素以及温度、溶解氧、pH、离子浓度、季节等环境因素的影响,也受麻醉剂配制方法及麻醉方法的影响。本研究中仅针对在适宜鲫生存的温度(室温)条件下,研究了不同浓度的乌拉坦对鲫的麻醉效果和麻醉剂安全范围,而鳃盖的呼吸频率也是反映鱼体麻醉深度的重要指标,代表了鱼的呼吸状态[18],本研究中尚未对其进行观察,对于多种影响因子以及生化指标也尚未作探讨,这些问题有待于进一步研究。

目前近30种鱼用麻醉剂各有优缺点,寻找作用可靠、速度较快、廉价且易得的麻醉剂是国际上研究的方向。作者认为,乌拉坦虽具有一定程度的毒性,但仍可开发为应用于急性试验的水产麻醉剂,乌拉坦将会成为水生、陆生动物共用的麻醉剂。

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PENG Yong,LIU Zhe,WU Yun-hui,JIANG Bin,LIU Ying-jie,SUN Man,ZHANG Yan-xia
(Department of Biomedicine Engineering,Yanshan University,Qinhuangdao 066004,China)

Abstract：The anesthetic effects of various concentrations(10,20,30,40,and 50 g/L)of Urethane on adult crucian carp Carassius auratus with body weight of 230 g±9.46 g were studied by bath at room temperature(15-25℃)to provide the practical anesthesia parameters.The results showed that the anesthesia time was reduced with the concentration increase and the recovery time was lengthened(P＜0.05)at concentration of 10-50 g/L,without significant difference compared to 40 g/L(P＞0.05).Within the concentration of 10-40 g/L,the fish in all groups had 100%of recovery,whereas the fish in the 50 g/L group had 88%of recovery rate.Within the concentration of 10-50 g/L,the fish in all groups had 100%of survival rate in 7 days,indicating that the anesthetic safety concentration was 40 g/L.The multi-comparison showed a significant relationship between concentration and drug bath time in bounce time on the crucian carp in air except the two concentration group(50 g/L and 40 g/L). There were no significant differences between the drug bath time in all groups(10 min and 5 min),and the drug bath time at 10 g/L for 25 min and 20 min(P＞0.05).The Urethane was found to have the valid anesthetic effects on crucian carp in a short time in acute experiments,and used as a kind of effective fish anesthetic.

Key words：Urethane;Carassius auratus;anesthesia time;recovery time;bounce time;recovery rate;7 day survive rate