Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾代谢酶的影响

(盐城工学院化学与生物工程学院,江苏省沿海池塘养殖生态重点实验室,江苏盐城224051)

摘要：将体质量为(11.35±1.52)g克氏原螯虾Procambarus clarkii暴露于不同亚致死浓度的Cu(Ⅱ) (0.055、0.28、1.38、6.88、34.38 mg/L)和Cd(Ⅱ)(0.0048、0.024、0.12、0.60、3.00 mg/L)溶液中96 h,测定其肌肉中碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)及肝胰腺中碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)的活性。结果表明:低浓度的Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)能诱导克氏原螯虾代谢酶的活性,肌肉和肝胰腺中代谢酶的活性均随Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)浓度的升高呈先升后降的趋势;Cd(Ⅱ)浓度为0.12 mg/L时,肝胰腺中ACP、AKP、GPT、GOT活性均达到最大值,分别较对照组提高了58.83%、86.17%、85.66%、70.98%(P＜0.05);Cu(Ⅱ)浓度为0.28 mg/L时,肝胰腺中ACP和AKP活性达最大值,分别较对照组提高了112.53%和94.98%(P＜0.05),Cu(Ⅱ)浓度为1.38 mg/L时,肌肉中ACP和AKP活性最高,分别较对照组提高了242.35%和171.97%(P＜0.05)。

碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)是生物体内两种重要的水解酶,直接参与磷酸基团转移,在体内细胞调节过程中起重要作用,并与DNA、蛋白质和脂质代谢有关,对生物体的生长具有重要意义;谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)则广泛存在于动物细胞线粒体中,是重要的氨基酸转氨酶,在机体蛋白质代谢中具有重要作用,其活性变化也是反映肝细胞生理状态的主要敏感指标。已有的研究表明,重金属能通过代谢抑制影响水生生物的生命活动[1-3]。

铜和镉是环境中普遍存在的两种重金属污染物。铜是动物体必需的微量元素,是虾类血液中氧载体——血蓝蛋白的中心原子[4],缺少铜会对其生长发育产生明显的影响,但当铜离子浓度超过机体调节范围且在体内积累过多时,则会引起中毒[5];而镉为生物非必需元素,具有残留时间长、能蓄积、可沿食物链转移蓄积、隐藏性和不可逆性等特点,对人体和水生动物均具有较强的毒害作用[6]。急性毒性实验表明,克氏原螯虾Procambarus clarkii具有较强耐受Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)污染的能力[7-8],但亚致死浓度的Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)对其代谢酶的影响目前尚未见报道。本试验中,作者研究了不同亚致死剂量的Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾肌肉中AKP和ACP活性以及肝胰腺中AKP、ACP、GOT和GPT活性的影响,以探讨Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾代谢的影响。

1 材料与方法

试验用克氏原螯虾购于盐城郊区龙虾养殖场,体质量为(11.35±1.52)g。

主要药品有:氯化镉(CdCl2·2.5H2O,分析纯),由上海金山亭新化工试剂厂生产;硫酸铜(CuSO4·5H2O,分析纯),由上海中试化工总公司扬州沪宝化学试剂有限公司生产。

1.2.1 试验设计及管理试验前在实验室暂养8 d,暂养期间连续充气,每天定时喂食1次,换水量为1/3,养殖用水为曝气24 h的自来水。暂养结束后挑选附肢齐全、健康的个体作为试验虾。

参考已有研究报道的安全浓度[7-8]确定本试验中溶液的浓度,按照等对数间距设置浓度梯度,

Cu(Ⅱ)的浓度设为0.055、0.28、1.38、6.88、34.38 mg/L,Cd(Ⅱ)的浓度设为0.0048、0.024、0.120、0.60、3.00 mg/L,同时设1个对照组,每组设3个平行。每个水族箱(100 cm×60 cm×80 cm)中加入试验溶液10 L,放入8只虾。试验期间不投喂,连续充气,每24 h换液一次,水温为(19±1)℃,没有虾死亡。试验时间为96 h,取肌肉、肝胰腺置于-20℃下保存备用。

1.2.2 指标的测定碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、蛋白含量均采用南京建成试剂盒测定,具体测定方法参照说明书进行。

原始数据经Excel 2003初步整理后,用SPSS 16.0统计软件进行方差分析,如差异显著,采用LSD法进行多重比较。试验结果用平均数±标准误表示。

2 结果

本试验结果表明,克氏原螯虾的ACP、AKP活性存在组织差异,肝胰腺酶活性高于肌肉。克氏原螯虾暴露于不同浓度的Cd(Ⅱ)溶液后,其肝胰腺中ACP、AKP、GOT、GPT活性和肌肉中ACP、AKP活性的变化趋势基本相同,均随Cd(Ⅱ)浓度的升高呈先升高后降低的趋势(图1)。

图1 Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)的影响
Fig.1 Effect of Cd(Ⅱ)on activifies of acid phosphatase,alkaline phosphatase,glutamic-oxalacetic transaminase and glutamic-pyruvic transaminase in red swamp crayfish Procambarus clarkii

注:*表示与对照组差异显著(P＜0.05)。
Note:*means significant difference compared with the control(P＜0.05).

从图1可见:肝胰腺中ACP、AKP、GOT、GPT活性均在Cd(Ⅱ)浓度为0.12 mg/L时达到最大,分别比对照组显著升高了58.83%、86.17%、85.66%、70.98%(P＜0.05);在Cd(Ⅱ)浓度为3 mg/L时,ACP活性较对照组降低了48.59% (P＜0.05),而AKP、GOT、GPT活性则与对照组无显著差异(P＞0.05)。

从图1可见:肌肉中ACP、AKP活性分别在Cd(Ⅱ)浓度为0.60 mg/L、0.12 mg/L时最高; ACP活性除最低浓度组(0.0048 mg/L)外,在浓度为0.024、0.12、0.6、3 mg/L时分别较对照组显著升高了162.79%、207.36%、224.42%和94.57%(P＜0.05)。

同Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾代谢酶的影响类似,克氏原螯虾肝胰腺中ACP、AKP、GOT、GPT活性和肌肉中AKP活性均随Cu(Ⅱ)浓度的增大呈先升高后降低的趋势(图2)。

从图2可见:肝胰腺中ACP、AKP活性在Cu(Ⅱ)浓度为0.28 mg/L时均达最大,分别比对

照组显著提高了112.53%和94.98%(P＜0.05); GOT、GPT活性在Cu(Ⅱ)浓度为6.88 mg/L时达到最大,其中GOT较对照组显著提高了120.22% (P＜0.05)。

图2 Cu(Ⅱ)对克氏原螯虾酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)的影响
Fig.2 Effect of Cu(Ⅱ)on activifies acid phosphatase, alkalinephosphatase,glutamic-oxalacetic transaminase and glutamic-pyruvic transaminase in red swamp crayfish Procambarus clarkii

肌肉中ACP活性随Cu(Ⅱ)浓度的增大呈上升趋势,在浓度为0.055、0.28、1.38、6.88、34.38 mg/L时分别比对照组显著升高了161.63%、147.29%、242.25%、182.17%和214.34%(P＜ 0.05);AKP活性在Cu(Ⅱ)浓度为1.38 mg/L时达最大,较对照组显著升高了171.97%(P＜0.05)。

3 讨论

代谢抑制是重金属对水生生物的致毒机制之一。窦亚卿等[9]的研究表明,Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)能明显抑制日本新糠虾Neomysis japonica体内ACP和AKP的活力。高浓度镉离子使罗非鱼Tilapia nilotica肝脏、心脏和鳃中的乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶活性显著下降,暴露于低浓度镉中,罗非鱼LDH在后期显著升高[3]。杨志彪等[10]研究发现,低浓度铜离子对中华绒螯蟹Eriocheir sinensis肝胰腺和血淋巴中ACP活性具有诱导作用,而高浓度铜离子(5 mg/L)具有抑制作用。与其相似,本研究结果表明,当Cu(Ⅱ)浓度为0.28 mg/L、Cd(Ⅱ)浓度为0.12 mg/L时,克氏原螯虾肝胰腺中ACP、AKP的活性最高,此浓度与这两种离子对克氏原螯虾的安全浓度较为接近[8],说明低浓度Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾ACP、AKP活性有诱导作用。尽管Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)对ACP、AKP活性均表现出诱导效应,但其作用机制可能不同。铜是机体的必需微量元素,不仅是虾类血氧蛋白的中心原子,还是细胞色素氧化酶、酪氨酸酶、过氧物歧化酶等许多酶类的重要组成部分。杨志彪等[10]认为,低浓度铜离子对中华绒螯蟹AKP的诱导作用可能是由于铜离子取代了AKP酶活性中心的锌离子,从而激活其活性,而当铜离子浓度增加时,锌离子已被完全置换出来,多余铜离子就会结合到酶的去活性位置上,以致酶的活力受到抑制。Cd是机体的非必需元素,水体中低剂量的镉离子通过鳃进入体内后,动物机体可产生大量热休克蛋白、金属硫蛋白(MT)等大分子应激蛋白,由于能量供应和应激分子的合成加强,通常表现为兴奋效应。暴露于高浓度镉离子中时,动物体内的氧化分解供应能力降低,表现为抑制效应。Cattani等[11]研究了镉对舌齿鲈Dicentrarchus labrax代谢的影响,舌齿鲈在浓度为0.5 mg/L和5.0 mg/L Cd(Ⅱ)中暴露4 h后,肝糖原迅速分解,肌肉中游离葡萄糖浓度迅速升高,同时在肝脏中大量诱导合成MT。本试验中设置的最高Cu(Ⅱ)浓度为34.8 mg/L,除肌肉中ACP活性显著升高外,其他代谢酶的活性均处于与对照组无显著差异的水平,说明克氏原螯虾对Cu(Ⅱ)有较强的耐受能力[7]。当Cd(Ⅱ)浓度为

3.0 mg/L时,克氏原螯虾肝胰腺中ACP活性受到显著抑制,而十倍于Cd(Ⅱ)的Cu(Ⅱ)浓度未明显抑制其代谢酶活性,也说明Cd(Ⅱ)较Cu(Ⅱ)对克氏原螯虾有更大的毒性。

代谢酶活性存在组织特异性。肝胰腺作为解毒器官和脂肪代谢场所,其水解酶类AKP、ACP含量较为丰富。本试验结果也表明,肝胰腺中ACP、AKP活性皆高于肌肉的。重金属对不同代谢酶的影响亦不同。李少菁等[12]研究发现,日本对虾Peneaus japonicus暴露于Zn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)中后,其AKP、GPT、GOT活性受到抑制,且抑制作用随离子浓度的增大而增强,这3种离子对ACP活性具有诱导作用,而且ACP活性随离子浓度的增大而增强。本试验中,克氏原螯虾肌肉中ACP、AKP活性和肝胰腺中AKP、ACP、GOP、GPT活性均随Cd离子浓度的增大而先升后降,而肌肉中ACP活性除Cd离子浓度为0.0048 mg/L外,其余各浓度均表现出显著的诱导效应。

[1] 汤鸿,李少菁,王桂忠,等.铜、锌、镉对锯缘青蟹仔蟹代谢酶活力影响的实验研究[J].厦门大学学报,2000,39(4):521-525.

[2] 赵维信,魏华,贾江,等.镉对罗氏沼虾组织转氨酶活性及组织结构的影响[J].水产学报,1995,19(l):21-27.

[3] 惠天朝,王家刚,朱荫湄,等.镉对罗非鱼脑AChE及组织中代谢酶的影响[J].浙江大学学报:农业与生命科学版,2004,30 (6):673-678.

[4] Brouwer M,Whaling P,Engel D W.Copper-metallothioneins in the American lobster Hamarus americanus:Potential role as Cu(I) donors to apohemocyanin[J].Environ Health Perspect,1986,65: 93-100.

[5] 刘发义,梁德海,孙凤,等.饵料中的铜对中国对虾的影响[J].海洋与湖沼,1990,21(5):404-410.

[6] 张翠,翟毓秀,宁劲松,等.镉在水生动物体内的研究概况[J].水产科学,2007,26(8):465-470.

[7] 董学兴,吕林兰,王爱民,等.Cu2+和Cd2+对克氏原螯虾幼虾的毒性效应研究[J].水生态学杂志,2010,3(3):90-93.

[8] 孙振中,林惠山,姚根娣,等.重金属等若干污染因子对克氏原螯虾的影响[J].水产科技情报,1995,22(3):107-110.

[9] 窦亚卿,杨筱珍,吴旭干,等.Cu2+和Zn2+对日本新糠虾生长、蛋白含量和体内磷酸酶活性的影响[J].海洋环境科学,2009, 28(6):611-614.

[10] 杨志彪,赵云龙,周忠良,等.水体铜对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)代谢酶活力的影响[J].海洋与湖沼,2006,37(2):118 -124.

[11] Cattani O,Serra R,Isani G,et al.Correlation between metallothionein and energy metabolism in sea bass,Dicentrarchus labrax,exposed to cadmium[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C,1996,113(2):193-199.

[12] 李少菁,王桂忠,翁卫华,等.重金属对日本对虾仔虾存活及代谢酶活力的影响[J].台湾海峡,1998,17(2):115-120.

Effects of Cu(Ⅱ)and Cd(Ⅱ)on metabolic enzymes in red swamp crayfish Procambarus clarkii

DONG Xue-xing,LÜ Lin-lan,HUANG Jin-tian,WANG Ai-min,YU Ye-bing,XU Hai-tao
(Chemistry and Biology Engineering College,Yancheng Institute of Technology,Key Laboratory of Aquaculture and Ecology of Coastal Pond of Jiangsu Province,Yancheng 224051,China)

Abstract：The alkaline phosphatase(AKP)and acid phosphatase(ACP)in muscle and hepatopancreas,glutamic -oxalacetic transaminase(GOT)and glutamic-pyruvic transaminase(GPT)in hepatopancreas were determined in red swamp crayfish Procambarus clarkia with body weight of(11.35±1.52)g exposed to different concentrations of Cu(Ⅱ)(0.055,0.28,1.38,6.88,and 34.38 mg/L)or Cd(Ⅱ)(0.0048,0.024,0.12,0.60,and 3.00 mg/L)at water temperature of(19±1)℃for 96 h.The results showed that low dose Cu(Ⅱ)and Cd(Ⅱ)had induction of activity of metabolic enzymes in the red swamp crayfish.Cu(Ⅱ)and Cd(Ⅱ)were found to result in increase in metabolic enzyme activities first and then decline.The maximal ACP,AKP,GPT and GOT activities in the hepatopancreas were observed at 0.12 mg/L Cd(Ⅱ),increased by 58.83%,86.17%,85.66%,70.98% compared to the control group(P＜0.05).The maximal ACP and AKP activities were found in the hepatopancreas of the crayfish exposed to 0.28 mg/L Cu(Ⅱ),increased by 112.53%,and 94.98%compared to the control group (P＜0.05),respectively.In the muscle,however,the maximal ACP and AKP activities were found at 1.38 mg/L Cu(Ⅱ),significantly increased by 242.35%and 171.97%compared to the control(P＜0.05).

基金项目：2008年第七批省级科技创新与成果转化(苏北科技富民强县)专项引导资金项目(BN2008233)