口虾蛄胚胎发育的研究

(1.大连海洋大学辽宁省海洋牧场工程技术研究中心,辽宁大连116023;2.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023)

摘要：在室内控温条件下对口虾蛄Oratosquilla oratoria的胚胎发育过程进行了观察。结果表明:口虾蛄从产卵到初孵假溞状幼体,需要经历受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠期、膜内无节幼体期、膜内溞状幼体期6个主要时期;水温为(21±1)℃、盐度为29时,口虾蛄胚胎发育历时18 d;水温、洞穴、光周期、饵料等因素均能影响亲虾蛄抱卵和幼体孵化。

口虾蛄Oratosquilla oratoria俗称虾爬子、螳螂虾、虾虎、琵琶虾等,又名“东方虾蛄”,隶属节肢动物门、甲壳纲、口足目、虾蛄科、口虾蛄属,是常见的海洋经济甲壳动物。口虾蛄主要分布于包括中国在内的西北太平洋诸国近海。其肉味鲜美,有很高的食用价值。近年来,由于过度捕捞与近海环境的破坏,导致口虾蛄资源严重衰退,自然产量很难满足市场需求。因此,口虾蛄生物学及其人工育苗与养成技术的研究已引起人们的关注。

Hamano等[1-4]和Matsuura等[5]于20世纪80年代开始研究了口虾蛄对人工洞穴的选择、交配行为、产卵和护卵行为、摄食等。Ohtomi等[6]和滨野龙夫[7-8]分别对口虾蛄的产卵场特征、产卵动态和虾蛄的洞穴及相关生态特性进行了研究。王春琳等[9]、徐善良等[10]、刘海映等[11]对口虾蛄的生物学特征及其繁殖生物学进行了研究;孙丕喜等[12]、王波等[13]、阎斌伦等[14]相继对口虾蛄的人工育苗技术进行了探索。另外,王春琳等[15-16]还对口虾蛄之近亲——黑斑口虾蛄Oratosquilla kempi的人工育苗技术及其胚胎和幼体发育时期脂类与脂肪酸的组成进行了研究。然而,有关口足目动物胚胎发育的研究至今尚未见报道。本试验中,作者在室内控温条件下培育口虾蛄亲体,跟踪观察产卵与胚胎发育的过程,旨在为口虾蛄的个体发育研究及其人工繁殖提供参考资料。

1 材料与方法

2009年4月28—30日,于大连市普兰店沿海收购已交配的雌虾蛄。选择体表无伤残、健康有活力的口虾蛄(210尾)作为试验用亲虾蛄。每尾体长为12 cm左右,体质量为32 g。

1.2.1 培育池培育池为30 m3的水泥池,其中铺设10 cm厚的海沙,埋入80个人工洞穴(聚乙烯管直径为6 cm);2个2.4 m3的玻璃钢观察池,其中铺设5 cm厚的海沙,各放置12个人工洞穴,此洞穴为绿色透明管状,半埋入沙中,以便观察虾蛄的产卵情况。池子上方覆盖双层遮阴网。采用加热器控制水温。

1.2.2 亲虾蛄培育将亲虾蛄于培育池中暂养,日换水量为1/2,水温恒定为(18±1)℃。每日早晚各投喂1次鲜活菲律宾蛤仔和沙蚕。培育前期,亲虾蛄的摄食量较大,投饵前检查以少有剩余为标准,确保亲虾蛄的营养;培育后期,待产亲虾蛄的摄食明显减少,此时应减少投饵,并及时清除残饵,保证水质良好。挑取临产的亲虾蛄转入观察池,每日升温1℃,至21℃时保持恒定,以促使产卵。

1.2.3 胚胎发育观察口虾蛄预产卵期间,每隔2 h观察一次,及时发现产卵口虾蛄,用镊子取卵,并记录产卵时间。胚胎发育前期,每隔30 min取卵细胞15粒于显微镜(Olympus CX41RF)下观察并拍照;后期胚胎发育速度较慢,取样频率随之降低,自囊胚期开始每隔8 h取卵1次。产卵与取样观察期间,采用加热器控制水温在(21±1)℃。

2 结果

前期的研究发现,温度对口虾蛄性腺发育影响显著,水温为(18±1)℃时性腺发育较快,而水温为(24±1)℃时性腺发育缓慢(结果另文发表)。因此,本试验中将亲虾蛄的培育温度控制为18℃左右。

亲虾蛄为俯卧产卵,其间以3对步足支撑洞壁,有时也用第二颚足和尾扇支撑,颚足辅助收拢卵团。刚产出的卵不粘连,随后卵粒间被附属腺分泌物连接。每个卵周围有多个卵柄,卵间形成立体的空间,而整个卵团也逐渐被一膜状物包裹。每尾口虾蛄的抱卵量约为3～5万粒。卵团由第一、三、四、五颚足抱于头胸部腹面,第二颚足用于防敌和辅助翻动、折叠卵团。取卵操作时,亲虾蛄受到刺激后,会紧抱卵团迅速返回洞穴深处躲避,有时甚至弃卵逃离,少数弃卵亲虾蛄待稳定后,能主动抱回卵团。人工送还卵团能协助亲虾蛄重新抱卵,但对同一亲虾蛄连续多次取卵会导致卵停止发育,最终死亡。

口虾蛄受精卵行不完全表面卵裂,胚胎发育经过受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、膜内无节幼体期、膜内溞状幼体期等典型时期。水温为(21±1)℃时,受精卵经过18 d孵化为Ⅰ期假溞状幼体。

2.2.1 受精卵刚产出的受精卵为不甚规则的球形,之后逐渐变圆,卵径为410～450 μm。卵黄量较多,分布于卵子中央,原生质分布于卵球表面,属中黄卵,卵为浅黄色(图1-A1、B)。卵粒间由附属腺分泌的“卵柄”相连(图1-C)。

2.2.2 卵裂期产卵后1 h(图1-A2),卵裂开始。此时卵质与卵黄分开,之间出现一明显裂沟,胚胎与卵膜出现明显分离(图1-A3)。口虾蛄受精卵为表面卵裂。经过10 h左右,受精卵不断分裂,依次进入4细胞期(图1-A4)、8细胞期(图1-A5)、16细胞期(图1-A6)至32细胞期(图1 -A7),此时可以见到分裂球大小不一,排列不整齐。

2.2.3 囊胚期产卵后25 h,细胞进一步分裂,数量不断增多,单个细胞体积不断变小,且无规则形状,沿着卵黄外缘下包,形成表面囊胚。此时,囊胚呈球形,四周一层细胞包围着中央的卵黄(图1-A8),受精卵进入囊胚期。

2.2.4 原肠胚期产卵后4 d,胚胎的一端出现透明区域,标志着进入原肠胚期。胚胎近前端不断分裂的细胞形成胚区(germinal area),随后其边缘形成一半圆形沟,此处细胞逐渐内陷,以此方式形成原肠(图1-A9)。陷入处即为原口或胚孔(blasto pore),是原肠腔与外界相通的开口,而整个区域称为内胚层盘。陷入的内胚层细胞吸收卵黄,逐渐由内向外扩展,较大的细胞在原口边缘呈圆锥柱状,其胞核与胞质靠外端,而内端充满卵黄。同时,囊胚腔逐渐缩小,由新生的原肠腔取代。原口形成后,胚区前端两侧的细胞迅速增殖,形成圆盘状的细胞群,左右对称排列,此为视叶原基,随后将发育为视叶,最终成为一对复眼(图1-A9)。原肠胚后期,原口两侧形成两个密集的细胞群,为腹板的原基。随着细胞的增殖,原基不断增大,并向原口处合并成为胸腹突。原口则被不断增大的胸腹突所封闭,最终消失。

2.2.5 膜内无节幼体期产卵后7 d,同侧视叶原基与胸腹突之间的细胞密度较其它部位增加,形成左右对称的两个细胞团,并逐渐增大且向外侧突出,发育成为大颚原基。在大颚原基与视叶原基之间,靠近大颚原基,出现一对细胞群突起,此为第二触角原基。随后,在第二触角原基与视叶原基之间又出现一对细胞群突起,为第一触角原基。大颚、第一触角与第二触角原基的出现是甲壳动物膜内无节幼体期的标志[17]。胸腹突不断增长、增厚,其末端凹陷,胚胎前端两侧的视叶原基细胞不断增殖,形成视叶(图1-A10)。此时,卵由黄色变为黄褐色。

口虾蛄与其它甲壳动物一样都以末端芽殖的方式产生新的体节与附肢。无节幼体3对附肢所对应的3个体节已完全愈合,之后在大颚节与尾节之间通过出芽形成新的体节及相应的附肢,自第一小颚开始,逐节发生。口虾蛄无节幼体期后期,头胸部形成两对小颚原基、两对颚足原基。胸腹突增长,出现体节。在胸腹突的背侧出现皱褶,为头胸甲原

2.2.6 膜内溞状幼体期产卵后11 d,随着胚胎透明部分所占比例的明显增加,卵黄的比例相应减少。复眼原基部位出现色素颗粒,标志着胚胎发育至溞状幼体期(图1-A11)。无节幼体期形成的3对附肢进一步增长、分节,呈肢芽状,末端出现刚毛。随着胸腹突细胞的不断增殖,在胸腹突基部相继形成3对步足原基。可观察到胸腹突末端背侧的心脏出现缓慢不规则地跳动。后期,头胸甲形成,胚胎分节明显,解剖能够较容易地区分头胸部、胸部和腹部(图1-A12)。临近破膜时,心跳连续,频率加快,胚胎有收缩动作,并越加剧烈(图1-D)。

图1 口虾蛄的胚胎发育
Fig.1 Embryonic development of the mantis shrimp

注:A各主要发育时期胚胎的形态特征,A1受精卵,A2极体排出,A3 2细胞期,A4 4细胞期,A5 8细胞期,A6 16细胞期,A7 32细胞期,A8囊胚期,A9原肠胚期,A10膜内无节幼体期,A11膜内溞状幼体期,A12破膜前期;B亲虾蛄抱卵,蓝色方框处为卵团;C显微镜下发育中的受精卵,箭头示卵柄;D正在破膜孵化的幼体。
Note:A embryonic features of major development stages,A1 fertilized egg,A2 polar body discharge,A3 two cell stage,A4 four cell stage,A5 eight cell stage,A6 sixteen cell stage,A7 32 cell stage,A8 blastula,A9 gastrula,A10 egg-nauplius,A11 egg zoea tage,A12 prehatching stage;B eggcarrying mantis shrimp,the blue frame showing eggmass brood;C fertilized egg under a microscope,the arrows showing egg stalk;D larva during hatching stage.

3 讨论

胚胎发育是动物个体发育与进化生物学研究的重要内容之一。虾蟹类动物种类众多,胚胎发育的形式复杂多样,其生物学特征往往因种而异。对于有抱卵习性的种类,胚胎发育往往要经历一段膜内幼体时期。中华绒螯蟹经历膜内无节幼体和膜内溞状幼体期而孵化出膜[18],而河流溪蟹等在淡水中繁殖的蟹类除了要经历上述两个发育时期外,还存在卵内大眼幼体期[19-20]。目前,有关虾蟹类膜内幼体的分期尚无统一观点。赵云龙等[21]将罗氏沼虾的胚胎发育过程分为卵裂期、囊胚期、原肠期、前无节幼体期、后无节幼体期、前溞状幼体期和溞状幼体期7个时期。慕峰等[22]认为,克氏原螯虾的胚胎发育可以分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠期、前无节幼体期、后无节幼体期、复眼色素期、预备孵化期和孵化期9个主要时期。依据不同时期胚胎的典型特征,细化分期无疑将有助于深入解析个体发育的生物学机理,但对于实际生产应用则略显繁琐。本研究中,作者综合现有观点,将口虾蛄胚胎发育过程分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠期、膜内无节幼体期、膜内溞状幼体期6个主要时期。其中膜内无节幼体期与膜内溞状幼体的分期分别以大颚、第一触角与第二触角3对附肢原基的出现,以及视叶色素的出现为划分依据。本研究结果表明,口足类动物个体发育过程更接近于蟹类与螯虾类,但与无节幼体时期就破膜孵化的对虾类差异明显[17],进而从发育学角度证明了口足类在甲壳动物中具有较高等的进化地位。

据报道,水温为26℃时,罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergi和红螯螯虾Cherax quadricarintus的胚胎发育时间分别为20 d和30 d以上[23-24]。本研究结果表明,在平均水温为21℃时,口虾蛄胚胎历时18 d孵化出膜,与胚胎发育过程相似的罗氏沼虾和红螯螯虾相比速度较快。据日本学者Hamano等[25]报道,虾蛄胚胎孵化时间与水温呈正相关,其关系式为D=58.39-1.85T(R=-0.98)。由此可知,温度越高,胚胎的孵化时间越短。然而,本试验中发现,当孵化温度高于24℃时,口虾蛄弃卵严重,胚胎易坏死或停滞发育。这说明口虾蛄胚胎正常发育的上限温度可能为21～24℃,而准确的温度上限有待于进一步研究。

人工采卵易导致亲虾蛄产生应激反应,同时破坏卵团的完整,受精卵容易坏死。因此,试验期间难以从同一个体的卵团中取卵,致使胚胎发育观察不连续。本试验中通过增加取样群体数量,并采取分别记录、取样的方法,将整个胚胎发育过程连接,以保证结果完整。然而取样个体的差异也会影响结果的准确性,在掌握口虾蛄受精卵发育最适条件的基础上,建立离体孵化技术是解决这一问题的有效途径。

据报道,日本沼虾Macrobrachium mipponensis离体受精卵在适当条件下能够正常孵化[26]。锯缘青蟹离体受精卵也能正常发育,孵化率达95%[27]。本试验中多次取出孵化早期(受精卵、二细胞期、8细胞期、囊胚期)的口虾蛄卵进行离体孵育,但发现离体卵不能正常发育,随着离体孵化时间的延长,胚胎颜色变深,并大量死亡。口虾蛄受精卵的离体孵化技术还有待于进一步研究。

[1] Hamano T,Matsuura S.Egg laying and egg mass nursing behaviour in the Japanese mantis shrimp[J].Nippon Suisan Gakkaishi, 1984,50:1969-1973.

[2] Hamano T,Matsuura S.Food habits of the Japanese mantis shrimp in the benthic community of Hakata Bay[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1986,52:787-794.

[3] Hamano T.Mating behavior of Oratosquilla oratoria[J].Crust Biol,1988,8:239-244.

[4] Hamano T.Growth of the stomatopod crustacean Oratosquilla oratoria in Hakate Bay[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1990,56:1529.

[5] Matsuura S,Hamano T.Selection for artificial burrows by the Japanese mantis shrimp with some notes on natural burrows[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1984,50:1963-1968.

[6] Ohtomi J,Shimizu M.Spawning season of the Japanese mantis shrimp Oratosquilla oratoria in Tokyo Bay[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1988,54(11):1929-1933.

[7] 濱野夫.石狩渲におけるシセコの巢穴と幼生および個侉群動能に閿ずる硚察[J].水產增殖,1989,37(3):156-161.

[8] 濱野夫.シヤコ類の生態

的研究[J].日本水産

仝誌, 1994,60(2):143-145.

[9] 王春琳,徐善良.口虾蛄生物学基本特征[J].浙江水产学院学报,1996,15(1):60-62.

[10] 徐善良,王春琳,梅文骧,等.浙江北部海区口虾蛄繁殖和摄食习性的初步研究[J].浙江水产学院学报,1996,15(1):30-35.

[12] 孙丕喜,张锡烈,汤庭耀,等.口虾蛄(Oratosquilla oratoria)人工育苗技术研究[J].黄渤海海洋,2000,18(2):41-46.

[13] 王波,张锡烈.口虾蛄人工育苗生产技术[J].齐鲁渔业, 1998,15(6):14-16.

[14] 阎斌伦,徐国成,李士虎,等.虾蛄工厂化育苗生产技术研究[J].淮海工学院学报,2004,13(1):50-52.

[15] 王春琳,郑春静,蒋霞敏,等.黑斑口虾蛄人工育苗技术研究[J].中国水产科学,2000,7(3):67-70.

[16] 王春琳,尹飞,宋微微.黑斑口虾蛄胚胎和幼体发育时期脂类及脂肪酸组成分析[J].浙江大学学报:理学版,2007,34(2): 224-227.

[17] 薛俊增,堵南山.甲壳动物学[M].上海:上海教育出版社, 2009:32-33.

[19] Pace F,Harris R R,Jaccarini V.The embryonic development of the Mediterranean freshwater crab,Potamon edulis(P.fluviatile) (Crustacea,Decapoda,Potamonidae)[J].J Zool,1976,180(1): 93-106.

[20] Wu H X,Xue J Z,Cumberlidge N.An extra embryonic phase in the true freshwater crab Sinopotamon yangtsekiense Bott,1967 (Decapoda,Potamidae)[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2010,28:725-730.

[21] 赵云龙,王群,堵南山,等.罗氏沼虾胚胎发育研究:Ⅰ.胚胎外部结构形态发生[J].动物学报,1998,44(3):249-256.

[22] 慕峰,吴旭干,成永旭,等.克氏原螯虾胚胎发育的形态学变化[J].水产学报,2007,31(增刊):6-11.

[23] 潘家模.罗氏沼虾养殖技术[M].上海:上海科学技术出版社,1997:17-19.

[24] 赵云龙,孟凡丽,陈立侨.不同水温对红螯螯虾胚胎发育的影响[J].湖泊科学,2000,12(1):59-62.

[25] Hamano T,Matsuura S.Egg size,duration of incubation,and larval development of the Japanese mantis shrimp in the laboratory [J].Nippon Suisan Gakkaishi,1987,53:23-39.

[26] 康现江,孙天才,王所安.日本沼虾受精卵的离体培养及其胚胎发育的初步观察[J].河北大学学报,1996,16(4):41-45.

[27] 韦受庆,罗远裕.青蟹胚胎发生的研究[J].热带海洋,1986,5 (3):57-62.

LIU Hai-ying1,QIN Yu-xue1,JIANG Yu-sheng2,WANG Gui-e1
(1.Center of Marine Ranching Engineering Science Research of Liaoning Province,Dalian Ocean University;2.Key Laboratory of North Mariculture,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Abstract：Embryonic development of mantis shrimp Oratosquilla oratoria was observed successively under a microscope.The embryonic development of the mantis shrimp was divided into six stages including fertilized egg,cleavage,blastula,gastrula,and egg-nauplius and protozoea stages.The embryos were found to take 18 d at water temperature of(21±1)℃and at a salinity of 29.0.The egg-carrying mantis shrimp and the embryonic development were primarily influenced by water temperature,artificial burrows,photoperiod,food supply,and environmental stability.The present study provides knowledge of the mantis shrimp biology,and for successful artificial breeding.

基金项目：国家海洋公益性行业科研专项经费项目(200905019);辽宁省科学技术计划项目(2008203002)