金属纳米颗粒对蛋白核小球藻生长活性的影响

(1.大连海洋大学理学院,辽宁大连116023;2.威海职业学院生物与化学工程系,山东威海264210)

摘要：研究了金属Fe、Ni纳米颗粒对蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa生长活性的影响,探讨了金属纳米材料的生物安全性问题。结果表明:Fe、Ni金属纳米颗粒不仅能吸附在藻细胞表面,造成其团聚沉淀,而且还能进入细胞内部,引起细胞的形变和结构损伤,从而抑制了小球藻的正常生长,降低小球藻的生物量,对小球藻具有一定的毒性效应。

由于纳米颗粒尺寸很小,结构特殊,因此具有许多优良且奇异的物理化学特性,如小尺寸效应、巨大的表面效应、界面效应、极高的反应活性、量子效应等,这些特性使其在医药、工业、建筑、化妆品和环保等产业中有着越来越广泛的应用前景[1-2]。其中金属纳米颗粒,如Fe等金属磁性纳米颗粒可以广泛地应用于磁性油墨、磁记录、静电复印、磁性流体、医学及磁共振显影剂等[1-3]。因此,人们的生存环境不可避免地受到金属纳米颗粒的影响。同时,金属纳米颗粒也进入到海洋生态环境中,进而通过食物链威胁人类的健康。目前国内外对纳米颗粒影响海洋生物安全性的研究不多,主要集中在动物组织生理生化检测[3-4]、微生物群体研究[5]等方面,另外还涉及较多重金属对藻类细胞影响的研究等[6-7]。

小球藻的细胞小,繁殖快,而且易获得,对毒物也较敏感。因此,小球藻是一种很好的测试生物,在较短时间内即可获得毒物对其多个世代及种群水平的影响评价。此外,研究纳米颗粒对其生长活性的影响作用机制同样适用于多细胞生物。本研究中,作者以蛋白核小球藻为测试生物,研究了两种金属纳米颗粒(Fe和Ni)对藻类生物的安全性,旨在为促进纳米科技的健康发展、纳米技术产品的安全应用提供参考资料。

1 材料与方法

试验用蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa由大连海洋大学辽宁省水生生物学重点实验室提供,培养液采用康威营养液配制。海水取自大连黑石礁海域,经沙滤后使用。金属纳米颗粒Fe和Ni由太极环纳米制品有限公司生产,粒径为(20±1)nm。

试验用主要仪器有:生物显微镜(XSP-8CE型40X-1600X),微量台式小型离心机(D-37520型),透射电子显微镜TEM(JEM-1200EX型),超声清洗仪(KH-500DB型),紫外-可见分光光度计(UV-1800型),智能光照培养箱(HP 300G型)。

1.2.1 小球藻的培养试验在250 mL锥形瓶中进行。将海水煮沸冷却后加入康威营养液(每升海水中加入1 mL康威营养液),再将处于对数生长期的小球藻接种到锥形瓶中,置于智能光照培养箱中培养,温度为(25±1)℃,光照为3 000 lx,光暗比为12∶12,试验藻液总量为100 mL。毒性试验的周期为5～6 d,其中急性毒性试验周期为96 h。将纳米颗粒的试验浓度设为0、0.4、2、10、25、50、100、200 mg/L,每个浓度组设3个水平。

每日定时摇晃,尽量使纳米颗粒与小球藻充分作用,每24 h在波长为680 nm处测定其吸光值,96 h时镜检,同时留取TEM观察的样品。

1.2.2 小球藻生物量的测定为实现小球藻生物量计数的快速准确,本研究中采用显微直接计数法和光密度(OD)测量法分别测量小球藻浓度值和吸光度值,制作标准曲线,然后根据相对误差分析和数理统计分析得出该曲线相关性较强,董正臻等[8]也证明了两者具有较高的相关性。使用吸光度值作为藻类生物量指标的方法更准确、方便,因此本研究中采用该方法确定小球藻的生物量。

1.2.3 TEM分析 TEM分析是观察纳米颗粒的进出机制,以及对细胞内部组织造成的影响的手段之一。首先制作超薄切片,再用双染色法染色之后置于TEM下观察分析。

2 结果与讨论

由图1可看出,随着Ni纳米颗粒浓度的增加,其对小球藻生物量的抑制效应增大。Ni纳米颗粒的浓度为0.4～25 mg/L时,其抑制效应较小;浓度超过50 mg/L时,初期(≥24 h)就出现抑制效应,并随着时间的推移毒性作用越来越明显。李永仙等[9]用氧化镍纳米颗粒对小球藻的试验结果也得出相似的规律。

图1 不同浓度的Ni、Fe纳米颗粒对小球藻生物量的影响
Fig.1 Effects of Ni,and Fe nanoparticles on biomass of Chlorella pyrenoidosa under different concentrations

由图1可看出:Fe纳米颗粒的浓度为0.4 mg/L时,其对小球藻的活性影响很小;随着浓度的增加,抑制作用也越来越明显,Fe纳米颗粒浓度为25～200 mg/L时,初期就出现抑制效应,并随着时间的推移毒性作用越来越明显。从Fe和Ni比较来看,较小剂量的Fe纳米颗粒就可对小球藻产生毒性效应,而Ni纳米颗粒则需要在较大的剂量下(≥50 mg/L)才会产生比较明显的毒性效应。

金属纳米颗粒对小球藻产生毒性作用可能与其在水溶液中分解出可溶性金属离子有关[10]。傅凤等[11]研究了纳米铜粉对藻类细胞的影响,结果表明,金属纳米颗粒对藻类具有一定的毒性,且产生一定的抑制效应;朱小山等[12]的试验结果也表明,氧化锌对藻类细胞有抑制作用。由此可见,金属纳米颗粒对小球藻存在显著的抑制效应。

将锥形瓶中的培养液摇匀,在同一液层取样,然后在生物显微镜下镜检并拍照(图2、图3)。在没有加入纳米颗粒时,小球藻分布均匀,无团聚现象(图2-(a)、图3-(a));加入较高浓度的纳米颗粒后,导致液体中出现不规则的团聚体(图2-(b)和图3-(b));将图2-(b)和图3-(b)中的局部放大,可见团聚体主要是由小球藻组成,局部包裹着纳米颗粒(图2-(c)和图3-(c))。由于纳米颗粒具有较强的吸附性,而藻类细胞也具有较强的吸附毒物的能力[13-15],导致纳米颗粒吸附在小球藻表面。从图3可见,Fe的纳米颗粒可以使小球藻形成较大、较多的团聚体,因而对小球藻的生长活性产生抑制效应。金属纳米颗粒的高表面能的性质使其极易在海水中团聚沉淀,所以较高浓度的纳

米颗粒可能导致小球藻形成团聚体后产生沉淀,这可能是金属纳米颗粒对小球藻毒性作用的方式之一。

图2 金属纳米颗粒Ni对小球藻团聚的影响(96 h)
Fig.2 The aggregation of Ni nanoparticles to Chlorella pyrenoidosa at 96 h

注:(a)为空白对照组(10×10);(b)为加入200 mg/L Ni后产生的团聚现象(10×10);(c)为(b)的局部放大(10×40)。
Note:(a),the control group(10×10);(b),the aggregation of Chlorella pyrenoidosa treated by 200 mg/L Ni nanoparticles(10×10);(c), the magnification of(b)(10×40).

图3 金属纳米颗粒Fe对小球藻团聚的影响(96 h)
Fig.3 The aggregation of Fe nanoparticles to Chlorella pyrenoidosa at the 96 h

注:(a)为空白对照组(10×10);(b)为加入200 mg/L Fe后产生的团聚现象(10×10);(c)为(b)的局部放大(10×40)。
Note:(a),the control group(10×10);(b),the aggregation of Chlorella pyrenoidosa treated by 200 mg/L Fe nanoparticles(10×10);(c), the magnification of(b)(10×40).

未添加纳米颗粒时,小球藻结构清晰完整,细胞呈球形,叶绿体中的类囊体片层结构清晰且面积较大,可看到结构完整清晰的细胞核、细胞壁、高尔基体和线粒体等(图4-(a)、(b))。加入Ni纳米颗粒96 h后,小球藻细胞形变程度较大,且结构损伤十分明显,此时藻细胞发生了明显的质壁分离现象,且质壁分离程度较大,有的藻细胞结构无法辨明(图4-(c)、(d)、(e))。可以看到类囊体的层状结构模糊且面积缩小,细胞核的膜界限不清,线粒体形状发生改变,且线粒体膜的界限十分模糊,嵴状结构也不明显,液泡面积较大且其中有较大的纳米颗粒(图4-(d))。将图4-(d)局部放大,在液泡中可以十分清楚地看到团聚的纳米颗粒(图4-(e))。加入Fe纳米颗粒96 h时,小球藻细胞出现形变,结构出现损伤,此时藻细胞出现质壁分离的现象,部分细胞即将溶解,类囊体面积缩小,其层状结构几乎消失,内部结构紊乱,线粒体形状发生改变,嵴数量减少,液泡数量较多,液泡中有较大团聚的纳米颗粒(图4-(f)、(g))。这与Clifford等[16]、Kyung等[17]对硅纳米材料的研究结果十分相似。

在两种金属纳米颗粒作用下,小球藻细胞内的液泡中都包裹着纳米颗粒,但在Fe纳米颗粒作用下的小球藻液泡数量却增加不少。这种现象是否为小球藻自身的一种解毒方式[18],还有待于进一步

研究。Nan等[19]也在透射电子显微镜下发现了硅纳米管进入细胞中,并被空泡结构包裹的现象,表明金属纳米颗粒可以进入藻细胞内部并对其内部结构造成一定损伤。

图4 不同条件下96 h时透射电子显微镜下小球藻的细胞结构
Fig.4 TEM images of Chlorella pyrenoidosa for the 96 h under different conditions

注:(a)、(b)为空白对照组;(c)、(d)、(e)为加入200 mg/L Ni 96 h时小球藻的细胞结构;(f)、(g)为加入200 mg/L Fe 96 h时小球藻的细胞结构;(b)、(d)、(g)分别为(a)、(c)、(f)的局部放大,其中(e)为(d)的再局部放大。T为类囊体;P为纳米颗粒;V为液泡;N为细胞核;M为线粒体;CW为细胞壁。
Note:(a),(b),the control groups;(c),(d),(e),the Chlorella pyrenoidosa treated by 200 mg/L Ni nanoparticles for 96 hours;(f),(g), the Chlorella pyrenoidosa treated by 200 mg/L Fe nanoparticles for 96 hours;(b),(d),(g),the magnification of(a),(c),(f),and(e)the magnification of(d).T,thylakoid;P,nanoparticles;V,vacuoles;N,cell nucleus;M,mitochondria;CW,cell wall.

3 结束语

本试验中,研究了两种金属纳米颗粒对测试生物小球藻的活性影响,结果表明:

1)金属Fe、Ni纳米颗粒对小球藻具有一定的毒性效应,且存在剂量-效应关系,并随着作用时间的增加,抑制效应越发明显。

2)金属Fe、Ni纳米颗粒极有可能附着在细胞的表面,使藻细胞团聚沉淀,还可以改变细胞膜的通透性,并进入细胞内部,损伤叶绿素类囊体的片层结构,从而影响藻类的光合作用。

3)将两种金属纳米颗粒的所有试验结果进行对比之后得出,Fe纳米颗粒在较小剂量下就可对小球藻产生毒性效应,而Ni纳米颗粒则需要在较大的剂量下(≥50 mg/L)才会产生比较明显的毒性效应。

随着金属纳米颗粒的广泛应用,纳米颗粒对水生生物的安全性问题日渐凸显,因此,与金属纳米颗粒相关的毒性机制有待进一步深入研究,以便为环境安全评价系统的建立提供更多依据,在保证纳米技术可持续发展的同时也使生态环境能够健康发展。

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The effect of the metal nanoparticles(Fe/Ni)on growth in algaChlorella pyrenoidosa

WANG Jing1,LIU Ya-chen2,QU Bing1,PAN Chao1,ZHAO Si-ru1
(1.School of Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Department of Biological and Chemical Engineering, Weihai Vocational College,Weihai 264210,China)

Abstract：The effect of the metal nanoparticles(Fe and Ni)on growth in alga Chlorella pyrenoidosa was studied to evaluate bio-security of the nanomaterials.The results showed that the biomass of the alga was reduced by the both metal nanoparticles which entered into the cells,and caused the cells deformation and damage in structure.The metals were absorbed by the cell surface and led to the alga aggregation.Thus,it is concluded that the metals are toxic to Chlorella pyrenoidosa.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(50773010);辽宁省科学技术计划项目(2008228002);辽宁省教育厅科技研究项目(2009A172)