微山湖产宽体金线蛭生化组成的分析

(1.上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海201306;2.牡丹江友博药业有限责任公司,黑龙江牡丹江157011)

摘要：对山东微山湖产宽体金线蛭Whitmania pigra的常规体组成、氨基酸、脂肪酸含量等进行测定及分析。结果表明:宽体金线蛭体中水分、粗蛋白、总脂肪、灰分和糖类的质量分数(鲜重)分别为85.61%、11.24%、0.95%、0.77%和1.43%;用氨基酸自动分析仪检测到宽体金线蛭体组织中总氨基酸含量为614.58 mg/g(干重),其中谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)和甘氨酸(Gly)含量较高,蛋氨酸(Met)含量较低。采用气相色谱仪检测到宽体金线蛭含有31种脂肪酸,其中廿碳烯酸占总脂肪酸的40.08%,尤以花生四烯酸(20:4n-6)含量最高,可达13.48%;油酸(18:1)含量占总脂肪酸的13.24%,单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)和高不饱和脂肪酸(HUFA)分别占总脂肪酸的35.31%、46.66%和24.41%;Σn-6PUFA/Σn-3PUFA比值达3.24,远远高于淡水鱼和海水鱼。宽体金线蛭独特的脂肪酸和氨基酸组成特点或许是其高药用价值的重要依据之一。

水蛭俗称蚂蟥,是环节动物门Annelida蛭纲Hirudinea动物的总称,它是中国传统的名贵中药材,具有破血逐淤、通经消癓的功效。常用于治疗中风、高血压、闭经、跌打损伤和淤血肿痛等[1]。从吸血型水蛭(菲牛蛭Hirudinaria manillensis、医用水蛭Hirudo medicinalis和日本医蛭Hirudo nipponica)中提取的水蛭素,是一种由65～66种氨基酸组成的酸性低分子多肽物质[2],被认为是目前最有效的天然抗凝剂。20世纪50年代中期,德国学者从医用水蛭中分离并鉴定了水蛭素,之后有关学者对水蛭素的药理学(如抗凝作用、对血小板各种细胞的影响、抗血栓效果、降血脂作用、对脑血肿和皮下血肿的影响)及水蛭素在试验动物体内的药代动力学等方面进行了广泛而深入的研究[3]。有关水蛭的研究,国外的研究主要集中在医学[4-6]、细胞生物学[7-8]和分子遗传[9]等领域;而国内的研究大多集中在水蛭素药理作用[3,10]、水蛭素的提取[2]及人工养殖技术[1,11-13]等。

宽体金线蛭Whitmania pigra隶属于真蛭亚纲Euhirdinea、无吻蛭目Arhynchobdelliada、黄蛭科Haemopidae、金线蛭属Whitmania,广泛分布于长江中下游地区及山东、河北、东北等地,是目前国内中药材市场上的主流药用水蛭种[14]。吸血型水蛭如菲牛蛭、医用水蛭和日本医蛭等体内含有的天然水蛭素,被认为是水蛭能够治疗心脑血管疾病的有效药用成分;而宽体金线蛭是一种非吸血型水蛭[11],体内不含天然的水蛭素。宽体金线蛭的有效药用成分目前尚不明确,有待进一步研究。

有关水蛭的生化组成,仅见苗艳丽等[15]对菲牛蛭氨基酸和脂肪酸进行了测定。微山湖是国内宽体金线蛭的重要产地,曾大量出口宽体金线蛭到日本和美国等地区。目前,随着宽体金线蛭野生资源的下降及需求的增加,有关宽体金线蛭的养殖探索也在逐步展开。本研究中,作者分析了微山湖产宽体金线蛭的体组成,以期为宽体金线蛭的人工养殖及在医学领域的进一步开发利用提供参考资料。

1 材料与方法

试验用宽体金线蛭于2008年10月采自山东微山县薛河养殖场,共50尾,体长为5.2～9.4 cm,体质量为3.2～6.5 g。将活体带回实验室暂养20 d

后进行试验。随机取30尾水蛭用吸水纸吸干体表的水分后,用于常规体成分的分析;其余20尾经冷冻、干燥、粉碎后,用于脂肪酸和氨基酸的分析。

1.2.1 常规体成分的测定采用国标(GB6435-86)105℃恒重法测定水分,采用国标(GB/ T6438-92)550℃马弗炉灼烧法测定灰分,采用凯氏定氮法在KDN-04定氮仪上测定粗蛋白,采用索氏(Soxhlet)抽提法测定粗脂肪,采用差减法测定糖类。每个样品的测定设3个平行。

1.2.2 氨基酸的测定将水蛭冻干样品粉碎后,经6 mol/L的盐酸溶液在110℃水解24 h。采用日立L-8800高速氨基酸自动分析仪测定总氨基酸含量。每个样品的测定设2个平行。

1.2.3 脂肪酸的测定将水蛭冻干样品粉碎后,参照Folch等[16]的方法用氯仿-甲醇法浸提脂肪,提取的脂肪用苯-石油醚(1∶1)溶液和0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液进行水解和甲酯化,静置30 min,取上清液离心后于HP6890A气相色谱仪上分析。样品测定设2个平行。

色谱分析条件:OMEGAWAX 320气相毛细管分析柱,30 m×0.32 mm×25 μm(Catalog No. 24152);进样口温度为260℃,N2为载气;柱内压为60 kPa。采用程序升温法:从60℃开始,以50℃/min的速率升至170℃;以2℃/min的速率升至180℃,保持2 min;以2℃/min的速率升至230℃,保持1 min;再以1℃/min的速率升至240℃,保持1 min。检测器为氢火焰离子检测器,分流比为5∶1,氢气流速为30 mL/min;注入空气的流速为300 mL/min,注入氮气的流速为25 mL/min。

以混合脂肪酸及单一脂肪酸标准品(Sigma产品)的分析图谱为参照,应用色谱分析软件,根据保持时间确定水蛭脂肪酸的种类,并用归一法计算各脂肪酸的百分含量。

2 结果

经测定,宽体金线蛭的常规体组成中水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分、糖类的质量分数(鲜重)分别为(85.61±0.09)%、(11.24±0.01)%、(0.95±0.02)%、(0.77±0.01)%、(1.43± 0.01)%。其中,宽体金线蛭的水分含量较高,灰分和粗脂肪含量较低。

从表1可见,宽体金线蛭的总氨基酸含量可达614.58 mg/g(干重)。在总氨基酸组成中,含量相对较高的氨基酸依次为:谷氨酸＞天冬氨酸＞亮氨酸＞赖氨酸＞甘氨酸,蛋氨酸含量最低。

表1 宽体金线蛭氨基酸的组成及含量(干重)
Tab.1 The amino acid content and composition in the leech,Whitmania pigra(dry matter)

注:*为必需氨基酸,ΣEAA为总必需氨基酸,其中色氨酸Try被水解;ΣNEAA表示总非必需氨基酸。
Note:*indicates the essential amino acids,ΣEAA means the total essential amino acids,and Try is hydrolyzed;ΣNEAA means the total non -essential amino acids.

氨基酸Amino acid Composition天冬氨酸含量/(mg·g-1) Content占百分比/% Asp67.26±1.4410.95±0.08苏氨酸Thr*27.00±0.984.39±0.03丝氨酸Ser29.59±1.394.81±0.09谷氨酸Glu96.92±3.0815.77±0.05甘氨酸Gly45.96±0.207.48±0.18丙氨酸Ala40.91±4.106.65±0.48缬氨酸Val*33.13±0.085.39±0.17蛋氨酸Met*7.91±0.641.29±0.07异亮氨酸Ile*21.44±0.613.49±0.00亮氨酸Leu*52.86±1.348.60±0.03酪氨酸Tyr22.86±0.763.72±0.02苯丙氨酸Phe*24.64±0.394.01±0.05组氨酸His24.64±0.283.77±0.06赖氨酸Lys*51.45±0.508.37±0.16精氨酸Arg41.83±1.626.80±0.07脯氨酸Pro27.69±0.484.51±0.05 NEAA396.18±13.3664.46±0.31 Total614.58±17.73100.00 ΣEAA218.41±4.3835.54±0.31 Σ

2)。其中含量较高的脂肪酸为20:4n-6、18:1、20:1、20:2n-6、16:0和16:1;各类脂肪酸的组成中,HUFA、PUFA、MUFA和SFA的含量分别占总脂肪酸的24.41%、46.66%、35.31%和18.03%。PUFA中Σn-6/Σn-3比值高达3.24。此外,宽体金线蛭中廿碳脂肪酸的含量很高,占总脂肪酸的40.08%。

表2 宽体金线蛭体脂肪酸占总脂肪酸的比例
Tab.2 The fatty acid profiles of the leech,Whitmania pigra

注:HUFA指碳原子数≥20且烯键数≥3的脂肪酸;PUFA指碳原子数在18～22且含有两个双键以上的不饱和脂肪酸;MUFA指含有1个双键的脂肪酸;SFA指饱和脂肪酸。
Note:HUFA means fatty acid with carbon atoms≥20,and olefinic bond≥3.PUFA means unsaturated fatty acids with the carbon atoms number between 18 and 22,and olefinic bond number≥2.MUFA means monounsafurated fatty acids.SFA means saturated fatty acid.

脂肪酸Fatty acid Composition 14:02.70±1.54 18:占百分比/% Composition脂肪酸Fatty acid占百分比/% 3n-91.00±0.15 14:10.30±0.13 18:3n-31.71±0.08 15:00.84±0.37 20:110.12±2.72 15:10.93±0.41 20:2n-69.39±2.48 16:08.84±3.27 20: 3n-60.70±0.12 16:2n-92.02±0.94 20: 3n-92.92±0.21 16:18.74±3.16 20: 4n-613.48±3.19 16:2n-61.22±0.53 20:5n-33.47±1.16 16:2n-31.63±0.13 21:00.81±0.30 17:01.22±0.52 22:11.26±0.61 17:10.72±0.14 22:2n-60.43±0.23 18:03.62±0.07 22: 4n-60.64±0.39 18:2n-90.53±0.07 22: 3n-61.81±0.90 18:113.24±1.22 22: 5n-30.42±0.22 18:2n-63.04±0.11 22:6n-30.97±0.51 18: n-6PUFA30.71±6.43 MUFA35.31±1.74 Σn-6/Σ n-3PUFA9.48±1.42 PUFA46.66±7.21 Σ 2n-31.28±0.42 SFA18.03±5.47Σ 40.08±9.64 n-33.24±0.20 HUFA24.41±6.46廿碳烯酸

3 讨论

一般而言,陆生动物的体成分中,水分为72.67%～78.62%(质量分数,下同)[17-20],鱼类的水分为73.60%～80.60%[21-24],虾类的水分为76.29%～78.76%[25-26],贝类(软体部分)的水分为74.57%～84.07%[27],环节动物门双齿围沙蚕的水分为84.1%[28]。本实验中测得宽体金线蛭的水分为85.61%,明显高于陆生动物,也比鱼虾等水生动物的水分高。这可能与宽体金线蛭主要靠吸食无脊椎动物的体液为生的摄食习性有关。

本研究中,宽体金线蛭的粗蛋白、总脂肪、灰分和糖类的含量占干物质的比例分别为78.11%、6.60%、5.35%和9.94%。与几种常见水生动物相比(表3):宽体金线蛭粗蛋白的比例与鱼类[21-24]、虾类接近[25-26],高于沙蚕[28]的含量;总脂肪的含量与沙蚕、鱼类相似,略高于虾类;灰分的含量与虾类、鱼类相近,远远低于沙蚕的含量;糖类的含量在沙蚕、虾类、鱼类的范围之内。

与几种常见水生动物相比(表4):宽体金线蛭体内的氨基酸总量为614.58 mg/g,远远高于菲牛蛭[15]和海蜇皮[29]的含量,低于仿刺参体壁[30]的含量,略高于双齿围沙蚕;赖氨酸的含量远远高于双齿围沙蚕的含量[28]。人体必需的氨基酸含量为218.41 mg/g。宽体金线蛭体中含量较高的氨基酸依次为:谷氨酸＞天冬氨酸＞亮氨酸＞赖氨酸＞甘氨酸,蛋氨酸含量最低,这与Monreal等[31]的研究结果相符。

宽体金线蛭的谷氨酸达到96.92 mg/g。当谷氨酸被人体吸收后,易与血氨形成谷酰胺,谷酰胺可作为脑组织的能量物质,改进维持大脑机能。谷氨酸还具有促进红细胞生成、改善脑细胞营养及活跃思维作用,是治疗肝昏迷、神经衰弱和记忆力减退的有效成分。天冬氨酸可作为K+、Mg+离子的载体向心肌输送电解质,从而改善心肌的收缩功能,同时降低氧消耗,在因冠状动脉循环障碍而缺氧时,对心肌有保护作用。亮氨酸可作为营养增补剂和调味增香剂。赖氨酸是人体的第一必需氨基酸,可降低血液中甘油三酯的水平,预防心脑血管疾病的产生,促进人体发育,增强免疫功能,并有提高中枢神经组织功能的作用。谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等氨基酸的大量存在或许正是水蛭药理作用的部分原因。

宽体金线蛭肌肉的脂肪酸组成齐全,含量丰富,含有31种脂肪酸。饱和脂肪酸(SFA)有6种,不饱和脂肪酸(UFA)为25种,其中高度不饱和脂肪酸(HUFA)8种。从表2可知,微山湖产宽体金线蛭的脂肪酸组成具有鲜明的特点:首先是饱和脂肪酸(SFA)含量很低,仅占总脂肪酸的18.03%,而多不饱和脂肪酸(PUFA)、单不饱和

脂肪酸(MUFA)和高不饱和脂肪酸(HUFA)含量较高;其次是廿碳烯酸含量很高,各种廿碳烯酸占总脂肪酸的比例高达40.08%;最后是n-6系列不饱和脂肪酸比例较n-3系列不饱和脂肪酸高,其Σn-6 PUFA/Σn-3 PUFA比值高达3.24,远超过淡水鱼和海水鱼的Σn-6 PUFA/Σn-3 PUFA值。一般淡水鱼体内Σn-6 PUFA/Σn-3 PUFA为0.6～1.9[31],海水鱼体内Σn-6 PUFA/Σn-3 PUFA为0.1～0.9[32]。菲牛蛭体中饱和脂肪酸(SFA)含量高于不饱和脂肪酸(UFA)含量,同样含有较高的单不饱和脂肪酸(MUFA),其中棕榈油酸含量最高[15]。

表3 常见水生动物的粗蛋白、粗脂肪、灰分和糖类含量占干物质的比例
Tab.3 The proportion of crude protein,crude lipid,ash and carbohydrate(in matter dry)of common aquatic animals w/%

水生动物aquatic animal粗蛋白crude protein粗脂肪crude lipid灰分ash糖类carbohydrate双齿围沙蚕[28]49.48～52.105.64～10.4819.52～29.1913.07～20.52虾类[25-26]70.70～90.971.22～5.605.20～7.301.40～20.50鱼类[21-24]75.62～91.642.83～15.563.95～6.672.92～17.13宽体金线蛭78.116.605.359.94

表4 不同水生动物氨基酸的含量及比较
Tab.4 The comparison of animo acid contents in different aquatic animalsmg/g

氨基酸amino acid Apostichopus japonicus天冬氨酸宽体金线蛭Whitmania pigra菲牛蛭[15] Hirudinaria manillensis双齿围沙蚕[28]Perinereisaibuhitensis海蜇皮[29] Rhopilima esculentum仿刺参体壁[30]Asp67.262.1449.311.669.1谷氨酸Glu96.920.2168.820.3116.1丝氨酸Ser29.590.6110.85.048.6组氨酸His24.640.4013.50.92.5甘氨酸Gly45.965.3936.419.7336苏氨酸Thr27.000.52216.235.7丙氨酸Ala40.911.4823.78.2102.4精氨酸Arg41.831.64339.349.6酪氨酸Tyr22.860.1717.53.19.2胱氨酸Cys00.698.316.70缬氨酸Val33.130.5128.18.022.3蛋氨酸Met7.910.2124.45.83.7苯丙氨酸Phe24.640.3828.16.37.3异亮氨酸Ile21.441.4021.54.616.8赖氨酸Lys51.450.9029.96.35.7亮氨酸Leu52.862.3431.15.818.5脯氨酸Pro27.690.3512.28.985.7氨基酸总量total amino acid 614.5819.66457.6146.6929.2

微山湖产宽体金线蛭体中单个脂肪酸以花生四烯酸(ARA)含量最高,达13.48%,而EPA的含量仅为3.47%。ARA属n-6系列的不饱和脂肪酸,是人体中最重要的多不饱和脂肪酸之一。

ARA及其代谢产物在人体内具有很强的生物活性,在许多疾病的病理生理过程中起着重要的作用。对血浆分析的结果表明,ARA能降低血糖、血脂和血液中胆固醇,并显著降低血液中低密度脂蛋白(LDL-C)和极低密度脂蛋白(VLDL-C),升高高密度脂蛋白(HDL-C),这对于预防心血管疾病具有重要意义[33]。

素E2(PGE2)、前列环素(PGI2)、血栓烷素A2(TXA2)、白细胞三烯LTD4以及LTC4等的主要前体物。这些生物活性物质对脂蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。例如PGE2能抑制血小板凝集和甘油三酯的分解,从而降低血中的游离脂肪酸,可用于冠心病及动脉粥样硬化的防治[34]。实验证明, LTD4和LTC4可引起明显的血管收缩和降低冠脉血流,是强效冠脉血管收缩剂[34],可致灌注心脏的收缩力下降,心输出量减少。ARA及其代谢物还能引起血管舒张,抑制血小板聚集,减少血栓的形成和组织缺血等生理机能的改变[34]。

单不饱和脂肪酸(MUFA)如油酸(18:1)、棕榈油酸(16:1)等对胆固醇有明显降低的作用。研究认为,MUFA可有效降低血浆中血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的含量,能够增强低密度脂蛋白的抗氧化能力,避免血管壁的激活,从而有效保护血管内皮,在一定程度上防止心血管疾病的发生[35]。棕榈油酸能够加强血管的代谢过程,可防止患高血压的大鼠患中风的危险[36]。

宽体金线蛭肌肉中油酸(18:1)的含量略低于花生四烯酸(ARA),油酸在降低血液胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的同时,还能升高对人体有益的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),因此可预防血栓形成,降低血压,从而减少引发心脑血管疾病的危险[37]。由于油酸对低密度脂蛋白胆固醇的作用呈中性,在降低高密度脂蛋白胆固醇的程度上比亚油酸低,没有多不饱和脂肪酸过量摄入后所带来的负面影响。因此,在某种程度上,单不饱和脂肪酸要优于多不饱和脂肪酸。另外,Grudy等的研究表明,高油酸膳食在降低低密度脂蛋白胆固醇和血清总胆固醇时,没有发现高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)下降[37]。

对脂肪酸与心血管疾病关系研究的最新研究结果表明,单不饱和脂肪酸在降低总胆固醇和有害胆固醇的同时,不会降低有益胆固醇[38]。另外,单不饱和脂肪酸具有特殊的物理化学特征和生理功能,具有调节人体脂质代谢以及治疗和预防心脑血管疾病等功效[39]。肖颖等[40]研究了富含单不饱和脂肪酸的坚果对血脂的调节作用,证实单不饱和脂肪酸具有调节高血脂大鼠血脂水平的作用。单不饱和脂肪酸可以降低血清中总胆固醇和载脂蛋白B的含量,提高载脂蛋白A的含量[41]。

综上所述,微山湖产宽体金线蛭的生化组成具有鲜明的特点,氨基酸中富含谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸,脂肪酸组成表现为低的饱和脂肪酸含量,高的廿碳烯酸含量,高的花生四烯酸含量和高的Σn-6PUFA/Σn-3PUFA比值。上述生化组成特点与宽体金线蛭药用价值是否直接相关,尚需做更进一步的药理学研究。

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The biochemical composition of leech,Whitmania pigra,collected from Weishan Lake,Shandong province

LÜ Dan1,HUANG Xu-xiong1,SUN Yue-song2,ZANG De-fa2
(1.Key Laboratory of Exploitation and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Ministry of Education,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Youbo Pharmaceutical Co.,LTD,Mudanjiang 157011,China)

Abstract：The body composition was analyzed in leech Whitmania pigra,an important aquatic animal for Chinese medicine,with body weight of 3.2-6.5 g collected at Weishan Lake in Shandong Province.It was found that the leech had moisture of 85.61%,crude protein 11.24%,total lipid 0.95%,ash 0.77%and carbohydrate 1.43%. There was total amino acid of 614.58 mg/g DW in the leech body,with more Glu,Asp,Leu,Lys and Gly and less Met.A total of 31 fatty acids were detected in the leech body with high proportion of eicosanoic acids(40.08%), especially arachidonic acid(ARA)(13.48%),oleic acid(18:1)(13.24%).The proportions of MUFA,PUFA and HUFA were found to be 35.31%,46.66%and 24.41%,respectively.The ratio of Σn-6PUFA/Σn-3PUFA fatty acid was 3.24 in the leech body,higher than that in freshwater or marine fish.It is therefore suggested that the high medical value of the leech be partially due to the fatty acid and amino acid compositions.