强壮箭虫的染色体核型分析

摘要：以强壮箭虫Sagitta crassa为试验材料,采用秋水仙素溶液浸泡、冷滴片、空气干燥及Giemsa染色等方法,对其染色体核型进行了分析。结果表明:强壮箭虫有9对染色体,其中6对为中部着丝点染色体(M);1对为亚中部着丝点染色体(SM);2对为端着丝粒染色体(T);其核型公式为2n=18=12M+2SM+ 4T。文中还比较了两种箭虫的染色体核型的差异。

有关浮游动物染色体的研究,国外主要集中在20世纪70年代以后,其中对桡足类染色体的研究最多,如Goswami等[1-3]先后对60多种桡足类的染色体进行了研究。国内关于浮游动物染色体的研究不多,截至2009年仅对20种浮游动物的染色体数目及组型进行了研究[4-13],其中卤虫1种[5],水母类4种[5],桡足类7种[6-8],枝角类7种[4,9-12]。关于毛颚动物染色体的研究,仅见对百陶箭虫Sagitta bedoti的研究报道[13]。强壮箭虫隶属于毛颚动物门、箭虫纲,主要分布于北太平洋西部,是黄、渤海浮游动物的优势种[14]。毛颚动物属于肉食性动物,以桡足类等小型浮游动物为食,同时它又是许多游泳生物的优质饵料,在海洋生态系统的结构与功能中起着重要的调控作用。但在毛颚动物的进化地位和系统分类中常出现混乱的现象[15]。本试验中,作者对强壮箭虫Sagitta crassa的染色体组型进行了研究,旨在为解决毛颚动物的分类学中的某些疑难问题及了解强壮箭虫的遗传学背景提供基础资料。

1 材料与方法

强壮箭虫于2010年4月采自大连市黑石礁海区。采回样品后立即在体式解剖镜下进行分类鉴定。选取健壮无畸形的个体在室内暂养一周,并投喂蒙古裸腹溞。试验前挑选活力强,体长为11～ 15 mm的个体20条,先饥饿12 h,使其排空消化道内的食物残渣。

1.2.1 体细胞染色体标本的制备选取10条活力强且通体透明、消化道内无食物残留的虫体,置于含体积分数为0.04%秋水仙素的海水溶液中30 h,再从中选取5条活力强的个体置于0.1 mol/L的KCl溶液中,4℃下低渗处理120 min。取出虫体,在新配制且在4℃下预冷的卡诺氏液(φ(无水甲醇)∶φ(冰乙酸)=3∶1)中固定3次,前2次每隔5 min更换固定液,第3次固定后放入冰箱(-20℃)中冷冻12 h。将虫体转移至洁净预冷的表面皿中,在解剖镜下迅速切除尾节,挑除卵巢。将去除尾节与卵巢的虫体转入-20℃下预冷的体积分数为60%的冰乙酸中,然后切成2～3 mm长度的小段浸泡软化30 min。软化完毕后用移液枪小心吹打数次,使细胞分散成细胞悬液。吸取细胞悬液在预冷的玻片上方约50 cm处进行滴片,然后置于酒精灯下微烤,烤干后在体积分数为10%的Giemsa染液(用pH为6.8的磷酸缓冲液稀释)中染色40 min。用净水小心冲去染液,在空气中干燥后用中性树脂封片。

1.2.2 精巢染色体的制备取制备体细胞染色体标本余下的尾节在体积分数为60%预冷的冰乙酸中软化10 min。用解剖针小心撕裂尾腔,轻轻挤压尾腔,使腔内成团的精细胞流出,再用移液枪轻轻

1.2.3 染色体核型分析在Olympus显微镜下观察,选择染色体分散良好、形态清晰的分裂相进行显微照相。统计体细胞、精巢细胞分裂相染色体数目。选取清晰的照片,使用Photoshop软件进行染色体测量[16],根据染色体大小依次编号并排列成核型图。按以下公式计算所测染色体的相对长度、臂比值和着丝点指数,并按Levan等[17]的标准划分染色体形态类型。

2 结果

在显微镜下检查强壮箭虫体细胞染色体分散较好的分裂相有56个。从表1可见:其染色体众数为18条的细胞有29个,占51.8%;少于18条的细胞数有25个,占44.6%;多于18条的有2个,占3.6%。基于以上数据初步确定,强壮箭虫的二倍体染色数目为2n=18。

从表2可见,共统计强壮箭虫精巢细胞分裂相有137个,其染色体众数为9的细胞有42个,占30.7%;染色体数为18的细胞有11个,占8.0%。这也证明强壮箭虫的二倍体染色数目为2n=18; 21个细胞染色体为36个的4n分裂相,占15.3%。

表1 强壮箭虫体细胞的染色体数目
Tab.1 The chromosome number in body cells in Sagitta crassa

总计染色体数目Cell number311323241529256出现几率Occurrence frequency/%5.31.81.85.33.55.3 Total细胞数项目Item Chromosome number≤8910111213141516171819 3.57.11.88.951.83.5100

表2 强壮箭虫精巢细胞的染色体数目
Tab.2 The chromosome number of testis cells in Sagitta crassa

总计染色体数目Chromosome number Cell number8542847911893212137出现率Occurrence frequency/%5.83.630.75.82.95. Total细胞数项目Item ＜789101112～1617181920～343536＞36 16.68.05.86.62.215.31.5100

测定并分析10个分裂相的染色体核型(图1、2),按照Levan[17]分类标准,强壮箭虫9对染色体可分为三组类型:6对为中部着丝点染色体(M), 1对为亚中部着丝点染色体(SM),2对为端部着丝点染色体(T)。故强壮箭虫的核型公式为2n= 18=12M+2SM+4T。表3中的编号是按染色体的相对长度从大到小排列而成。

表3 强壮箭虫的染色体核型分析测量
Tab.3 Measurements of karyotypes in Sagitta crassa

染色体序号/对Chromosome No.相对长度/% Relative length臂比值Arm ratio着丝点指数Kinetochore index类型Classification 1 2 3 4 5 6 7 8 9 16.96±0.98 16.20±1.53 12.53±0.70 11.43±0.02 10.61±0.51 9.95±0.90 9.41±0.25 6.57±0.56 6.35±0.43 1.06±0.05 1.00±0.01 2.01±0.89 1.32±0.29 1.26±0.48 1.16±0.15 1.15±0.06 / / 48.50±4.67 49.94±8.38 44.33±5.31 46.56±1.09 33.26±4.71 43.07±5.85 46.25±1.22 / / M M S M M M M M T T

图1 强壮箭虫的体细胞核型
Fig.1 Metaphase chromosome and karoytype in body cells in Sagitta crassa

图2 强壮箭虫的次级精母细胞核型
Fig.2 Metaphase chromosome and karoytypes in the secondary spermatocytes

3 讨论

目前有关毛颚动物核型的研究报道很少,主要是由于制备毛颚动物染色体标本比较困难。目前常用于染色体核型分析的动物细胞主要有四种:首先是用植物凝集素(PHA)处理动物后取得的血细胞,常用于鱼类、小鼠等脊椎动物;其次是胚胎细胞,常用于不易取得血液的小型动物,如虾、蟹等甲壳类;再是动物新生组织细胞,常用于那些具有高度再生能力的动物,如涡虫、水蛭等;最后是体细胞,常用于世代周期短、体细胞分裂频率高的小型动物,如浮游生物中的枝角类与桡足类。

强壮箭虫的体型较小,成体为1～2 cm,无血液循环系统,常用的制备具有大量分裂期细胞的方法均不适用。因此,制备具有高分裂比例的细胞群是该类动物核型分析的关键。多次试验发现,采用降低秋水仙素浓度、延长处理时间的方法会提高处于分期细胞的比例,但长时间处理可能会导致染色体高度螺旋,不利于核型分析。本试验中采用低秋水仙素浓度(体积分数为0.04%)并浸泡30 h的处理方法。由于处理时间长,得到的分裂相大部分染色体高度浓缩,可用于染色体计数,但若对染色体组进行分带染色等进一步的核型分析,还需要改进制片方法。在制备强壮箭虫精巢染色体标本时,要挑选尾腔中有大量的性细胞团随尾腔液一起流动的个体,此类个体精巢发育处于第三时期,精巢细胞分裂旺盛,制片效果最好。另外,值得一提的是,在精巢染色体中还观测到21个细胞染色体为36个的4n分裂相,占15.3%(图3)。由于制备精巢染色体标本时采用的是整个尾节,因此,这部分分裂相除了初级精母细胞外还可能含有体细胞。

本试验结果表明,强壮箭虫染色体数目为2n= 18,这与Bone等[18]在《毛颚动物生物学》中记述的肥胖箭虫S.enflata染色体数目(2n=18)一致。

曹文清等[13]对百陶箭虫染色体的核型进行了分析,结果为2n=16,与强壮箭虫接近。进一步比较强壮箭虫与百陶箭虫的核型,发现两者核型非常相似。百陶箭虫的8对染色体中,5对为中部着丝点染色体;1对为亚中部着丝点染色体;2对为亚端部着丝点染色体。即两者都有一条亚中部着丝点染色体,两条端部或亚端部着丝点染色体,仅相差一条中部着丝点染色体。

图3 强壮箭虫出现的4n分裂相
Fig.3 Metaphase tetraploid chromosome in Sagitta crassa

毛颚动物的结构特殊,同种个体随环境变化常发生明显的形态变化,其进化地位、系统分类常出现混乱现象[15],强壮箭虫染色体数目与肥胖箭虫一致,核型与百陶箭虫接近。这显示了彼此间的亲缘关系,同时也显示了种间的差异。当然,地理位置和生活环境的改变会导致动物染色体出现多态现象。对毛颚动物箭虫纲的各种类进行进一步的核型分析研究,将有助于解决毛颚动物分类学中的某些疑难问题,这是一项非常有意义的工作。

[1] Goswami U,Goswami S C.Karyology of the genus Labidocera Lubbock from the Laccadive Sea(Lakshadweep)[J].Indian Journal of Marine Sciences,1979,8:259-261.

[2] Goswami U,Goswami S C.Chromosomal aberrations found in Paracalanus aculeatus(Giesbrecht)at the time of solar eclipse[J]. Mahasagar-Bull Nation-Inst Ocean,1982,15(1):59-62.

[3] Goswami U,Goswami S C.A note on chromosomes of Pontellopsis herdmani and Pontella princeps(Copepoda)from the Laccadive Sea [J].Mahasagar-Bulletion of the National Institute of Oceanography,1984,17(2):129-132.

[4] 张明凤,曾错,陈寅山,等.隆线溞生殖细胞成熟分裂过程中染色体的组型观察[J].中国水产科学,2009,16(6):868-877.

[5] 曹文清,方旅平,林元烧,等.我国海洋浮游动物染色体研究进展[J].海洋科学,2003,27(12):23-26.

[6] 曹文清,林元烧,林加涵.几种海洋浮游动物染色体组型的初步研究[J].台湾海峡,1994,13(3):275-278.

[7] 曹文清,林元烧,张跃军.火腿许水蚤染色体组型的初步研究[J].厦门大学学报:自然科学版,1994,33(6):853-856.

[8] 毛连菊,张从尧,赵文.2种桡足类的染色体组型分析[J].中国水产科学,2002,9(2):129-132.

[9] 曹文清,王永聪,林元烧.多刺裸腹溞染色体实验研究[J].台湾海峡,1995,14(3):284-287.

[10] 曹文清,林元烧,郭东辉,等.蒙古裸腹溞染色体组型研究[J].台湾海峡,1999,18(1):71-75.

[11] 赵文,张鹏,霍元子,等.西藏拟溞的染色体核型研究[J].大连水产学院学报,2004,19(3):167-170.

[12] 张鹏,赵文,孙静娴.5种裸腹溞的核型及亲缘进化关系的研究[J].大连水产学院学报,2009,24(2):109-113.

[13] 曹文清,张跃军,林加涵.厦门港百陶箭虫染色体核型的研究[J].厦门大学学报:自然科学版,1994,33(增刊):121-124.

[14] 郑执中,肖贻昌.毛颚动物作为中国海及其邻近水域海流指标种的初步探讨[C]//中国海洋湖沼学会1963年学术年会论文摘要汇编.北京:科学出版社,1964:84-86.

[15] 肖贻昌.中国动物志:无脊椎动物第三十八卷毛颚动物门箭虫纲[M].北京:科学出版社,2004.

[16] 杨大翔.用Adobe Photoshop进行核型分析[J].农业网络信息,2005(3):45-46.

[17] Levan A,Fredga K,Sandbergm A A.Nomenclature for centrometric position on chromosomes[J].Hereditas,1964,52(2):201-220.

[18] Bone Q,Kapp H,Pienot-Bults A C.The Biology of Chaetognaths [M].Oxford:Oxford University Press,1991:16-17.

LIU Qing,YUAN Feng,WANG Bi-xue,WANG Ren-feng
(Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Abstract：The chromosome karyotypes of Chaetognath Sagitta crassa,a popular zooplankton species in the Yellow Sea and the Bohai Sea,were studied in the samples collected in Heshijiao bay in April of 1995 by means of cooldropping method.The results showed that the metaphase chromosome number of the samples were found n=9,2n= 18,with karyotypic formula 2n=12M+2SM+4T.A comparison,analysis and discussion on the chromosome karyotypes of the Chaetognaths Sagitta crassa and Sagitta enflata were submitted.