雌激素对双齿围沙蚕性比、生长和卵母细胞发育的影响

(大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,辽宁大连116023)

摘要：将性未分化的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis暴露在双酚A和17β-雌二醇两种雌激素下,研究了雌激素对双齿围沙蚕雌雄比例、个体生长、死亡率及卵母细胞发育的影响。结果表明,两种雌激素各浓度下的试验组沙蚕均为雌性。与对照组相比,双酚A浓度为50、100 μg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用(P＜0.01);浓度为10、150 μg/L时,对沙蚕的促生长作用显著(P＜0.05);浓度为200 μg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;沙蚕的死亡率随双酚A浓度的提高而增加。与对照组相比,当17-β雌二醇浓度为1、5、15 mg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用(P＜0.01);浓度为30 mg/L时,对沙蚕的促生长作用显著(P＜0.05);浓度为45 mg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;随着浓度的提高,沙蚕的死亡率明显加大。双酚A浓度为10～150 μg/L、17β-雌二醇浓度为1～30 mg/L时,对沙蚕卵母细胞的生长有明显的促进作用(P＜0.01);而双酚A浓度为200 μg/L(P＜0.05)和17β-雌二醇浓度为45 mg/L(P＜0.01)时对卵母细胞的生长有抑制作用。

关键词：双齿围沙蚕;17β-雌二醇;双酚A;生长;雌雄比例;卵母细胞发育

随着工业的快速发展,雌激素类的化合物对环境的污染越来越严重。大量的实验证实,多种雌激素对动物的繁殖、生长有雌激素效应。林君卓等[1]研究了17β-雌二醇对鲻脑垂体促性腺激素细胞分泌活动的影响,认为17β-雌二醇对鲻性腺提早发育有促进作用;方永强等[2]探讨了17β-雌二醇诱导鲻雌性化机制,结果揭示了诱发鲻雌性化的机制可能是通过芳香化酶的介导;黄晔等[3]研究了17β-雌二醇对雄性斑马鱼卵黄蛋白原mRNA的诱导效应,发现随着17β-雌二醇的浓度升高和时间的延长,mRNA表达量显著增加。关于双酚A也有一些研究,如李惠云等[4]提出,高浓度双酚A对鲫血清雌二醇水平有显著促进作用,而低浓度组促进作用不明显;沈万贇等[5]报道了双酚A对斑马鱼繁殖的影响,发现随着双酚A浓度的增加,雌鱼产卵量增大,但当双酚A浓度达到1 000 μg/L时,雌鱼的产卵量降低,雄鱼的精细胞数量也逐渐降低。双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis多栖息于河口滩涂,其幼体和成体均可作为检测水域污染的良好生物指标[6],但利用其作为研究雌激素对环境影响的指示生物目前尚未见报道。为此,本试验中作者以双齿围沙蚕为研究对象,探讨了17β -雌二醇和双酚A对其雌雄比例、个体生长、生殖细胞发育的影响,旨在为环境雌激素的研究提供基础资料。

1 材料与方法

双齿围沙蚕于2008年10月9日取自大连庄河养殖场,共880条,个体重为(0.01±0.0003)g,体节数为10±2。取回后暂养于大连海洋大学海水增养殖学与生物技术重点开放实验室。

1.2.1 试验设计与管理参考相关文献[9-10]中的方法,试验中设置6个浓度组:双酚A浓度分别为0(对照组)、10、50、100、150、200 μg/L;

17β-雌二醇浓度分别为0(对照组)、1、5、15、30、45 mg/L。每个浓度设3个平行。试验在2 L的塑料量杯中进行,每杯加入100 mL细沙(用80目筛绢网过滤)和500 mL含有不同浓度雌激素的海水,放入40条沙蚕。每天上午去除量杯内的海水,投喂人工配合饵料(为海参配合饲料(呈粉末状),购于大连海洋大学育苗基地),干露2 h后,分别加入相应试验浓度的海水。每7～10 d更换量杯内的细沙。水温为13℃,盐度为31。试验共进行200 d,试验结束时统计其死亡率。从每个处理组随机取50条沙蚕,于体积分数为30%的酒精中麻醉,用直尺测量体长,用电子秤称重。

1.2.2 沙蚕性别的观察在沙蚕后三分之一体节处用解剖针挑破一个疣足,用载玻片沾取疣足处体液,在10倍光镜下观察其生殖细胞类型,鉴别沙蚕性别。

1.2.3 生殖细胞的观察从每组随机取5条沙蚕固定于Bouin's液中,用常规石蜡包埋,切片厚度为6 μm,H·E染色,Olympus显微镜下观察并拍照,同时用目微尺测量疣足中100个初级卵母细胞的直径,统计无卵黄和卵黄形成期初级卵母细胞所占比例。

2 结果

从表1可见:双酚A浓度为50、100 μg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用(P＜0.01);浓度为10、150 μg/L时,对沙蚕的促生长作用显著(P＜0.05);浓度为200 μg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显(P＞0.05)。沙蚕的死亡率随双酚A浓度的提高而增大。

从表2可见:与对照组相比,当17β-雌二醇浓度为1、5、15 mg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用(P＜0.01);浓度为30 mg/L时,对沙蚕的促生长作用显著(P＜0.05);浓度为45 mg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显(P＞0.05)。随着浓度的提高,沙蚕的死亡率明显加大。

表1 双酚A对沙蚕生长和死亡率的影响
Tab.1 Effect of BPA on growth and mortality in the sluge worm Perinereis aibuhitensis

注:*表示与对照组差异显著(P＜0.05),**表示与对照组差异极显著(P＜0.01),下同。
Note:*means significant difference compared with the control(P＜0.05);**means very significant difference compared with the control(P＜0.01),et sequentia.

ρ(双酚A)/ (μg·L-1)体长/cm body length体质量/g body weight死亡率/% mortality 0(对照) 10 50 100 150 200 2.786±0.04 3.090±0.01*3.160±0.04**3.667±0.04**3.010±0.01*2.790±0.03 0.050±0.01 0.060±0.01*0.065±0.02**0.077±0.02**0.062±0.01*0.051±0.01 10.83±1.94 11.67±1.69 12.50±1.48*12.50±1.79*22.50±2.85**30.83±2.36**

表2 17β-雌二醇对沙蚕生长和死亡率的影响
Tab.2 Effect of 17β-estradiol on growth and mortality in the sluge worm Perinereis aibuhitensis

ρ(17β-雌二醇)/ (mg·L-1)体长/cm body length体质量/g body weight死亡率/% mortality 0(对照) 1 5 1 5 30 45 2.590±0.02 3.113±0.05**2.720±0.04**2.710±0.05**2.613±0.04*2.570±0.04 0.059±0.01 0.068±0.01**0.065±0.01**0.063±0.02**0.060±0.01*0.044±0.02 11.00±1.41 11.67±1.03 11.67±1.34 15.00±1.11**16.67±1.61**28.33±1.55**

从每组随机取30个个体检测雌雄性别,结果表明:对照组中雄性个体占16.67%,雌性占83.33%,而各试验组沙蚕个体均为雌性。

2.3.1 双齿围沙蚕不同发育阶段的初级卵母细胞组织学切片结果显示,沙蚕的初级卵母细胞最早发生于疣足内表皮(图1-a);当细胞直径达8 μm时从上皮脱落,进入疣足腔内(图1-b);直径约50 μm时,从疣足腔进入体腔,并游离于体腔液中(图1-c)。疣足内的卵母细胞包含无卵黄期初级卵母细胞和卵黄形成期初级卵母细胞两种(图1-d)。无卵黄期初级卵母细胞呈圆形,大小为12～25 μm,核仁直径为8～11 μm,细胞内无卵黄颗粒(图1-e);卵黄形成期初级卵母细胞呈椭圆形,长径×短径为(41.5±2.5)μm×(28.7±2.2)μm,核仁的长径×短径为(12.9±0.5)μm×(12.6± 0.6)μm,胞质中出现卵黄颗粒和空泡状物质(图1-f)。

图1 雌激素对双齿围沙蚕不同发育阶段初级卵母细胞的影响
Fig.1 The different stages of the primary oocytes in the sluge worm Perinereis aibuhitensis

注:a、b疣足内的初级卵母细胞,×200;c体腔内的初级卵母细胞,×200;d疣足内的初级卵母细胞,×100;e、f疣足内的初级卵母细胞,×200。YC示无卵黄期细胞;VC示卵黄形成期细胞。
Note:a,b.the primary oocyte in parapodium,×200;c.the primary oocyte in coelome,×200;d.the primary oocyte in parapodium,×100;e, f.the primary oocyte in parapodium,×200.YC:yolkless cell;VC:vitellogenesis cell.

2.3.2 雌激素对初级卵母细胞大小的影响从图2可见:双酚A浓度为10、50、100、150 μg/L时,各试验组沙蚕卵母细胞的直径有递增趋势;而200 μg/L浓度组与对照组相比,沙蚕卵母细胞的直径有所减小,且差异显著(P＜0.05)。

从图2可见:当17β-雌二醇浓度为1、5、15 mg/L时,沙蚕卵母细胞的直径有递增趋势;而当17β-雌二醇浓度为45 mg/L时,与对照组相比沙蚕卵母细胞的直径有所减小,且差异显著(P＜0.05)。

图2 双酚A和17β-雌二醇对沙蚕卵径的影响
Fig.2 Effects of BPA,and 17β-estradiol on the diameter of oocytes in the sluge worm Perinereis aibuhitensis

2.3.3 雌激素对卵母细胞组成的影响不同浓度双酚A、17β-雌二醇的各试验组沙蚕疣足中卵母细胞的组成情况见表3、4。从表3可见:暴露于双酚A的10、50、100、150 μg/L浓度组中,沙蚕卵黄形成期细胞所占的比例均高于对照组,且差异极显著(P＜0.01);暴露于200 μg/L浓度中,卵黄形成期细胞所占的比例极显著降低(P＜0.01)。

从表4可见:暴露于17β-雌二醇1、5、15、30 mg/L浓度组中,沙蚕卵黄形成期细胞所占的比例均高于对照组,且差异极显著(P＜0.01),其中17β-雌二醇浓度为1、5、15 mg/L时各组沙蚕卵黄形成期细胞所占的比例呈递增趋势;浓度为45 mg/L时,沙蚕卵黄形成期细胞所占的比例较对照组极显著降低(P＜0.01)。

表3 双酚A组中沙蚕疣足内卵母细胞的组成比例
Tab.3 Effects of BPA on the primary oocyte proportion in parapodium in the sluge worm Perinereis aibuhitensis

ρ(双酚A)/ (μg·L-1)无卵黄期细胞yolkless cell卵黄形成期细胞vitellogenesis cell卵黄形成期细胞所占比例/% vitellogenesis cell/yolkless cell 524848.0 10425858.0**50326868.0**100366464.0**150406060.0**200485245.0 0 **

表4 17β-雌二醇组中沙蚕疣足内卵母细胞的组成比例
Tab.4 Effects of 17β-estradiol on the primary oocyte proportion in the parapodium in the sluge worm Perinereis aibuhitensis

ρ(17β-雌二醇)/ (mg·L-1)无卵黄期细胞yolkless cell卵黄形成期细胞vitellogenesis cell卵黄形成期细胞所占比例/% vitellogenesis cell/yolkless cell 0 434646.0 1 425858.0**326868.0**15366464.0**30465454.0**45485240.0 5 **

3 讨论

已有研究表明,雌激素对水生生物生长有一定的影响,低浓度的雌激素有促进作用,但高浓度的雌激素有抑制作用。任维美[7]用弱雌激素混合物燃料木因处理金鲈,能使鲈增重;刘学讯等[8]用己烯雌酚投喂虹鳟,发现该物质对虹鳟鱼苗的体长和体质量都有促进作用。关于雌激素对生物生长的抑制作用也有报道,如刘红玲等[9]研究了双酚A对大型溞和斑马鱼的毒性,结果发现,高剂量的双酚A对斑马鱼胚胎发育有明显的抑制作用;Brown等[10]研究指出,长期暴露于壬基酚环境中的片脚类动物(Amphipod),其种群密度和生长速度明显降低。本试验中也得出相似的结论。性类固醇激素对鱼体生长和代谢的调节作用已经被人们所认知,它通过促进鱼类摄食和提高饵料转换效率,从而促进鱼类的生长[11-12]。进一步研究还发现,17β-雌二醇能使金鱼[13]和鲤[14]血液中的生长激素(GH)含量增加。采用离体研究的结果表明,17β-雌二醇能在脑垂体水平上对GH基础分泌和由促性腺激素释放激素(LHRH)及促甲状腺素释放激素(TRH)刺激的GH分泌进行调解[15]。雌激素对沙蚕促生长作用机理是否与鱼类相似还需进行深入的研究。

刘学讯等[8]研究了用己烯雌酚诱导虹鳟的全雌化,发现己烯雌酚剂量为5 mg/kg时有诱导虹鳟鱼性转变的效果;高艳丽等[16]利用17β-雌二醇诱导施氏鲟,最终导致施氏鲟全雌化;方永强等[2]用17β-雌二醇投喂性腺未分化的鲻,高剂量组的鲻全被诱导为雌鱼,低剂量组鲻的雌性率达90%,而对照组鱼为雄鱼。本试验中利用17β-雌二醇和双酚A对双齿围沙蚕进行6个多月的雌激素浸泡刺激,结果发现沙蚕全部变成雌性个体,说明双酚A和17β-雌二醇对沙蚕雌性化有诱导作用。通过性激素处理,可以将沙蚕遗传型雄性转变为表型雌性。关于性分化的机理,对鱼类研究的较多,如Gelinas等[17]研究发现,金鱼脑内存在细胞色素P450芳香化酶基因等。沙蚕体内是否含有类似基因,还需做一系列试验确定。同时本试验中还发现,对照组沙蚕雌、雄比例为5∶1,与试验前期在海区调查的结果相符,但与黄猛[18]报道的雌、雄比例为1∶1不同,这可能与采样季节有关。

关于雌激素对卵母细胞发育影响的报道不多。本试验中将性未分化的双齿围沙蚕暴露于双酚A和17β-雌二醇中,研究了雌激素对卵母细胞发育的影响。结果发现,除双酚A浓度为200 μg/L和17β-雌二醇浓度为45 mg/L试验组外,其余各试验组沙蚕的卵母细胞卵径与对照组相比明显增大(P＜0.01),卵黄形成期细胞所占的比例也有较大提高(P＜0.01)。这说明雌激素在较低的浓度下,对卵母细胞发育有促进作用,但浓度过高对卵母细胞的生长则有抑制作用。前人的研究已证实,雌二醇、双酚A对鱼类卵黄的生成有促进作用[3,19],但对沙蚕的促进机理还需进行深入的研究。

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Effects of estrogen on sex proportion,growth and oocyte development of sluge worm Perinereis aibuhitensis

LI Xia,SONG Zhen-ping,WANG Fu-jing,Qin Yan-jie,YANG Da-zuo,ZHOU Yi-bing
(Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Abstract：The sex ratio,growth,mortality and oocyte development were studied in sluge worm Perinereis aibuhitensis exposed to bisphenol A(at concentration of 0,10,50,100,150,and 200 μg/L)and 17β-estradiol(at concentration of 0,1,5,15,30,and 45 mg/L.The results showed that all females were observed in the sluge worm exposed to the two estrogens.Compared with the sluge worm in the control group,the sluge worms had very significantly better growth in the bisphenol A groups at a concentration of 50 and 100 μg/L(P＜0.01),and significantly better growth in the bisphenol A groups at a concentration of 10 and 150 μg/L(P＜0.05),without significant difference at a concentration of 200 μg/L.However,there were significantly higher mortality in the experimental groups as the increase in concentration of bisphenol.The sluge worms had very significantly better growth in the groups with 17β-estradiol concentrations of 1,5 and 15 mg/L(P＜0.01),while the sluge worm in the group with 30 mg/L showed a significant increase(P＜0.05).The mortality of the sluge worms was found to be increased with increase in concentrations of 17β-estradiol in the experimental groups.There were very significantly higher growth of the oocytes in the Bisphenol A groups(at a concentration of 10-150 μg/L),and in the 17β estradiol groups(at a concentration of 1-30 mg/L)(P＜0.01),but growth of the oocyte was inhibited in the groups with 200 μg/L bisphenol-A and 45 mg/L 17-β estradiol.

Key words：Perinereis aibuhitensis;17-βestradiol;bisphenol-A;growth;sex proportion;oocyte development

基金项目：国家“863”计划项目(2006AA10Z410);国家海洋公益性行业科研专项经费项目(200805069)