几种中草药对海水养殖中常见病原菌的抗菌作用

(大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点实验室,辽宁大连116023)

摘要：采用水煎煮法、微波乙醇提取法和微波水提取法对补骨脂、肉桂、黄连、五倍子、石榴皮、大黄、黄芩、苦参、乌梅、白头翁10种中草药进行提取,并用其提取液对海水养殖中7种常见致病菌(灿烂弧菌Vibrio splendidus、黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi、哈维氏弧菌Vibrio harveryi、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、迟钝爱德华氏菌Edwardsiellosis tarda、海豚链球菌Streptococcus iniae、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida)的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)进行了测定,同时进行联合药敏试验,研究了几种中草药对海水养殖中常见病原菌的抗菌作用。结果表明:五倍子和石榴皮的抑菌杀菌效果最好,五倍子的MIC分别为0.78～1.56 mg/mL(水煎煮法、微波水提取法)、0.39～1.56 mg/mL(微波乙醇提取法),石榴皮的MIC分别为1.56～3.13 mg/mL(水煎煮法)、0.78～1.56 mg/mL(微波乙醇提取法)、0.78～3.13 mg/mL(微波水提取法);五倍子的MBC分别为3.13～6.25 mg/mL(水煎煮法)、1.56～3.13 mg/mL(微波乙醇提取法、微波水提取法),石榴皮的MBC分别为6.25～25 mg/mL(水煎煮法)、3.13～6.25 mg/mL (微波乙醇提取法、微波水提取法)。其次是黄连、黄芩和乌梅,而大黄、补骨脂、肉桂、苦参、白头翁的抑菌、杀菌效果一般或者较弱。用3种方法提取的中草药对7种病原菌的抗菌作用依次为:微波乙醇提取法提取液≥微波水提取法提取液≥水煎煮法提取液。联合药敏试验结果表明,复方五倍子与乌梅、五倍子与甘草对灿烂弧菌,黄芩与甘草对迟钝爱德华氏菌,石榴皮与乌梅对海豚链球菌,五倍子与石榴皮、五倍子与黄芩对黄海希瓦氏菌的抑制分别有协同作用,该结果可为水产养殖临床用药提供参考资料。

近年来,随着水产养殖规模的不断扩大、养殖种类的增加以及环境的日益恶化,各类水产养殖病害呈频发的态势,其中细菌性疾病仍是最常见、危害最大的一类疾病。针对水产动物的细菌性疾病,养殖中主要采取药物、免疫和生态防治等方法,其中药物防治仍是目前应用最多,也是最简单、最直接的方法[1]。中草药因具有天然、廉价、副作用小等优点而备受青睐,尤其使用中草药可避免耐药性和药物残留超标等问题,符合生产绿色水产品的疾病防治原则[2]。目前国外使用中草药防治疾病的报道不多,中草药主要作为免疫增强剂使用,如泰国、韩国学者进行了艾蒿、五倍子等的抗菌作用研究[3-4]。中国在水产动物疾病防治中使用中草药的历史较长,但多数使用在淡水养殖生产中,且对中草药的研究多集中于对其药效的观察和比较方面,并进行了气单胞菌[5-7]、假单胞菌[8]、爱德华氏菌[9-10]、弧菌[11]等水产病原菌对部分中草药的敏感性试验。而对大多数中草药的用药量则根据经验或沿用人医、兽医的用量参照给药,尤其对海水病原菌抗菌活性的系统研究缺乏资料,配伍也缺少科学依据。为此,本研究中作者采用不同方法分别提取10种中草药,用其提取液对海水养殖中7种常见的病原菌进行了体外抑菌、杀菌试验和联合药敏系列试验,以便为进一步临床应用提供参考资料。

1 材料与方法

试验用中草药为补骨脂、肉桂、黄连、五倍子(去虫尸)、石榴皮、大黄、黄芩、苦参、乌梅和白头翁,均购于大连奇运生药店。

试验用灿烂弧菌Vibrio splendidus(AP722)、黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi(AP629)均由农业部海洋水产增养殖学重点实验室分离自患病仿刺参;哈维氏弧菌Vibrio harveryi(ATCC14126)、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus(KCTC2471)、迟钝爱德华氏菌Edwardsiellosis tarda(SU100)、海豚链球菌Streptococcus iniae(KCTC3657)、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida(MT004)均由韩国釜庆大学鱼病预防实验室赠送。

1.2.1 中草药有效成分的提取 1)水煎煮法每种中草药分别取20 g,加水200 mL,浸泡0.5 h煎煮沸腾后文火煮0.5 h,过滤煎液,将药物残渣继续煎煮,共煎煮3次,合并滤液,浓缩至1 g/mL含药量,于4℃下保存(48 h内使用)。

2)微波乙醇提取法每种中草药分别取20 g,经粉碎机粉碎后,加入体积分数为70%的乙醇溶液200 mL,浸泡0.5 h后,置于微波炉(NJL07-3型试验专用微波炉,南京杰全微波设备有限公司生产)内,通过调节脉冲时间间接控制温度,使之保持在沸点以下,提取10 min,将药液过滤,浓缩药液至20 mL,使其含药量达到1 g/mL,于4℃下保存(48 h内使用)。

3)微波水提取法每种中草药分别取20 g,经粉碎机粉碎后,加入蒸馏水200 mL,浸泡0.5 h后,置于微波炉内,通过调节脉冲时间间接控制温度,使之保持在沸点以下,提取12 min(水比乙醇水溶液的沸点高),将药液过滤,浓缩药液至20 mL,使其含药量达到1 g/mL,于4℃下保存(48 h内使用)。

1.2.2 中草药的体外抗菌作用 1)单味中草药的抗菌活性将7种病原菌分别接种于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB,添加15 g/L NaCl)培养基中,置于26℃恒温培养箱中培养24 h。离心(8 000 r/min,20 min)去除培养基,用生理盐水重悬离心洗涤2次,用生理盐水稀释至病原菌终浓度为2 ×106个/mL。

每种中草药提取液设置10个浓度梯度(2倍倍比稀释),每个梯度设置3个平行组,每种中草药设置1个空白对照组,进行7种病原菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的抗菌试验。具体操作如下:

1#试管中预先加入1.8 mL MH肉汤(MHB,添加15 g/L NaCl),2#～10#试管中分别加入1 mL MH肉汤,之后将0.2 mL药液加入1#试管中,混匀。再从1#试管取出1 mL加入到2#试管,依次类推至10#试管,最后10#试管弃去1 mL,每个梯度试管中均加入50 μL的菌悬液,对照管中加入1 mL MH肉汤及50 μL的生理盐水。26℃下培养, 24 h后肉眼观察细菌的生长情况,无菌生长的最高稀释梯度为药物的最低抑菌浓度(MIC)。将无菌生长的最高稀释梯度细菌悬液涂布于相应的平板上,于26℃下培养24 h,无菌落生长且含药量最少的浓度值即为最低杀菌浓度(MBC)。

2)联合药敏试验药敏纸片制备的方法如下:将新华1号定性滤纸用打孔器打成直径为6 mm的纸片,于121℃下灭菌20 min,100℃下烘干;将灭菌后的纸片放于水煎煮法提取的药液中(每110张吸药1 mL,每张纸片饱和含药量为9 μL)浸泡并翻动0.5 h;在无菌干燥培养皿中摊开,吹干,再置于无菌加塞小瓶中,最后置于干燥器中或者冷冻保存备用。

按照每一种致病菌分别对应10种中草药的药敏纸片,每两种药敏纸片达到两两相距2 cm的原则,进行药物的联合抑菌试验。每组设1个平行。操作方法如下:将0.5 mL菌悬液(8×105个/mL)涂布于MH琼脂(添加15 g/L NaCl)平板上,表面稍干后贴上预先制备好的药敏纸片,26℃下恒温培养24 h,测量抑菌圈直径并拍照。根据抑菌圈之间的细菌生长状况(药物之间相邻一侧和药物相背的单独一侧的抑菌圈的大小相比较),药物的关系划分为协同、拮抗和相互间无作用。

2 结果

2.1.1 水煎煮法用水煎煮法提取的中草药对7种病原菌的体外抑菌、杀菌结果表明:五倍子、石榴皮的抑菌杀菌效果最好,MIC分别为0.78 mg/mL(2株)、1.56 mg/mL(5株)和1.56 mg/mL (4株)、3.13 mg/mL(3株),MBC分别为3.13 mg/mL(5株)、6.25 mg/mL(2株)和6.25 mg/mL (5株)、12.5 mg/mL(1株)、25 mg/mL(1株);其次是黄连、黄芩和乌梅,而大黄、补骨脂、肉桂、苦参、白头翁的抑菌效果一般或较弱(表1)。

2.1.2 微波乙醇提取法用微波乙醇法提取的中草药有效成分对7种病原菌的体外抗菌试验结果趋势与水煎煮法的结果较为一致,但是整体抑菌、杀菌效果要比水煎煮法好(表2)。如五倍子和石榴皮的MIC分别为0.39 mg/mL(1株)、0.78

mg/mL(5株)、1.56 mg/mL(1株)和0.78 mg/mL(2株)、1.56 mg/mL(5株),MBC分别为1.56 mg/mL(3株)、3.13 mg/mL(4株)和3.13 mg/mL(3株)、6.25 mg/mL(4株)。

表1 用水煎煮法提取的中草药有效成分对致病菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
Tab.1 The bacteriostatic and bactericidal effect of Chinese herb medicines by boiled water extractionmg/mL

注:-表示未测出,下同。Note:-indicates the undeteclable,et sequentia.

药物灿烂弧菌MICMBC黄海希瓦氏菌MICMBC哈维氏弧菌MICMBC副溶血弧菌MICMBC迟钝爱德华氏菌MICMBC海豚链球菌MICMBC杀鲑气单胞菌MICMBC补骨脂25-2510050-50-2510050100100-肉桂50-2510050-50-5010012.55025100黄连3.13256.252512.510012.55012.5506.25256.2550五倍子0.783.131.563.131.566.250.783.131.563.131.563.131.566.25石榴皮1.566.253.1312.53.13251.566.251.566.251.566.253.136.25大黄12.525255012.550255012.55025502550黄芩25506.2525255012.5502510025502550苦参100-50-50-100-----100-乌梅50-251002510050100251002510025100白头翁251002510025-25-50-2510050-

表2 用微波乙醇法提取的中草药有效成分对致病菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
Tab.2 The bacteriostatic and bactericidal effect of Chinese herb medicine by ethanol microwave extractionmg/mL

药物灿烂弧菌MICMBC黄海希瓦氏菌MICMBC哈维氏弧菌MICMBC副溶血弧菌MICMBC迟钝爱德华氏菌MICMBC海豚链球菌MICMBC杀鲑气单胞菌MICMBC补骨脂25-251002510050-2510050-50100肉桂100-12.55012.510012.5-2510012.55050100黄连3.1312.53.1312.53.1312.56.252512.5506.25256.2525五倍子0.391.560.783.130.783.130.781.560.783.131.563.130.781.56石榴皮1.563.131.566.251.566.250.783.130.783.131.566.251.566.25大黄6.2512.525506.2512.5255012.525255012.550黄芩12.5256.252512.5506.252512.52512.5506.2525苦参50-50-2510050-50-50-50100乌梅2510012.510012.51002510012.55012.510012.5100白头翁2510050-50-25-50-2510050-

2.1.3 微波水提取法用微波水提取法提取的中草药的有效成分对病原菌的体外抗菌试验结果基本上与其它两种方法的效果一致,但抑菌效果更接近于微波乙醇提取法,只是整体效果稍低于后者(表3)。如五倍子和石榴皮的MIC分别为0.78 mg/mL(4株)、1.56 mg/mL(3株)和0.78 mg/mL (1株)、1.56 mg/mL(5株)、3.13 mg/mL(1株), MBC分别为1.56 mg/mL(1株)、3.13 mg/mL(6株)和3.13 mg/mL(2株)、6.25 mg/mL(5株)。微波水提取法与水煎煮法相比,对多数菌株的MIC和MBC降低一个浓度级;而与微波乙醇提取法相比,对部分菌的MIC和MBC数值高一些。

表3 用微波水提取法提取的中草药有效成分对致病菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
Tab.3 The bacteriostatic and bactericidal effect of Chinese herb medicine by bioled water microwave extractionmg/mL

药物灿烂弧菌MICMBC黄海希瓦氏菌MICMBC哈维氏弧菌MICMBC副溶血弧菌MICMBC迟钝爱德华氏菌MICMBC海豚链球菌MICMBC杀鲑气单胞菌MICMBC补骨脂50-50-100-50-50-50-100-肉桂50-251002510025502510050-50-肉桂50-251002510025502510050-50-五倍子0.781.560.783.130.783.130.783.131.563.131.563.131.563.13石榴皮1.566.253.136.251.566.250.783.131.566.251.566.251.563.13大黄12.525255012.525251002550255012.550黄芩12.5256.252512.5256.252512.52512.55012.550苦参50-50-2510050-50-100-50-乌梅50-12.51002510025100251002510025100白头翁25-50-50-25-50-2510050-

根据抑菌圈的形状、大小和扩散方向,从10种中草药对7种病原菌的联合药敏试验结果中共筛选出6组有协同作用的中草药复方。黄芩与甘草(复方一,图1-A)相邻一侧的抑菌圈比两者相背一侧的抑菌圈明显扩大,表明复方黄芩与甘草对抑制爱德华氏菌有明显的协同作用。五倍子与甘草(复方二)、五倍子与乌梅(复方三)(图1-B)均是相邻一侧的抑菌圈比两者相背一侧的抑菌圈显著扩大,尤其是甘草两端相差极为明显。由此判断五倍子分别与乌梅、甘草对抑制灿烂弧菌具有明显的协同作用。石榴皮与乌梅(复方四,图1-C)相邻一侧的抑菌圈比两者相背一侧的抑菌圈明显扩大,而补骨脂分别与石榴皮、乌梅相邻一侧和相背一侧的抑菌圈没有差别。由此判断石榴皮与乌梅对抑制链球菌存在明显的协同作用。五倍子与石榴皮(复方五)、五倍子与黄芩(复方六)(图1-D),均是相邻一侧的抑菌圈比两者相背一侧的抑菌圈明显扩大。由此判断五倍子分别与黄芩、石榴皮存在协同作用,两组复方药对黄海希瓦氏菌的抑制效果明显增强。

图1 中草药的联合药敏试验
Fig.1 Susceptibility test of pathogenic bacteria to the combination of Chinese herbal medicines

注:A迟钝爱德华氏菌Edwardsiellosis tarda;B灿烂弧菌Vibrio splendidus;C海豚链球菌Streptococcus iniae;D黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi。

3 讨论

补骨脂、肉桂、黄连、五倍子、石榴皮、大黄、黄芩、苦参、乌梅、白头翁10种中草药的提取液对灿烂弧菌、黄海希瓦氏菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、海豚链球菌、迟钝爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌7种致病细菌的体外抑菌、杀菌试验结果表明:五倍子、石榴皮、黄芩、黄连和乌梅的抑菌、杀菌效果较为明显,其中五倍子和石榴皮的抑菌效果最好,其次为黄芩、黄连和乌梅。

前期研究已证实,五倍子对温和气单胞菌[12-13]、爱德华氏菌[13]、柱状屈桡杆菌[13]、嗜水气单胞菌[14]、弧菌[11]等均具有明显的抑制或杀灭作用。本研究结果表明,五倍子较其它9种药物对7种海水病原菌的抑制作用最广泛且明显,该结果与前人的研究结果一致。同时可以证明,五倍子提取液不仅对淡水病原菌效果好,对海水病原菌也同样具有显著抗菌活性。本研究中用于测定抗菌活性的病原菌中有3种可导致仿刺参患病,为此,根据本试验结果,作者将五倍子用于仿刺参细菌病的预防和治疗试验,并取得了较好的效果(另文发表)。五倍子富含鞣酸,对革兰氏阳性菌和阴性菌均有较强的抑制和杀灭作用,具有抗菌解毒、收敛止血、敛肺降火、祛腐生新、涩肠止泻等作用[15]。五倍子在医学、兽医及淡水养殖生产中被广泛使用,关于对其杀菌机理的研究也较多。据黄为华[16]报道,鞣质中的O-H键波长正好在许多细菌长度范围之内,化学键的共振有杀菌的作用,并列举了化学抗菌药物的分子结构加以验证。石榴皮中含鞣质、蜡、树脂、甘露醇、糖、树胶、菊粉、黏质、没食子酸、苹果酸、果胶、草酸钙、异槲皮甙和石榴皮碱等[15]。已有研究表明,石榴皮对哈维氏弧菌、河流弧菌和鳗弧菌均具有很好的抑制作用[17-18]。本研究结果表明,石榴皮不仅对弧菌具有很强的抑制作用,对海水来源的爱德华氏菌、链球菌、气单胞菌等也具有很好的抑菌杀菌效果。

黄芩、黄连在临床上属常用中药,其有效成分为黄酮类化合物和小檗碱。罗琳等[19]的研究表明,黄芩对鱼害粘球菌具有很好的抑菌效果,最低抑菌浓度为1.56 mg/L。钟全福等[20]的研究表明,黄芩、黄连对非01群霍乱弧菌、温和气单胞菌、鲁氏不动杆菌、迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均具有明显的抑制作用。本试验结果表明,黄芩、黄连对海水病原菌也同样具有较强的抗菌活性。乌梅富含有机酸,具有一定的杀菌作用。邱庆连等[11]的研究表明,乌梅对拟态弧菌、梅氏弧菌和霍利斯弧菌均具有抗菌活性,最低抑菌浓度为0.461～0.922 mg/mL。本试验结果显示,乌梅对7种海水病原菌也具有抑制作用。

由此可见,五倍子、石榴皮、黄芩、黄连和乌梅可用于海水养殖中细菌性疾病的防治,具有进一步的开发价值。

本试验结果表明:用微波乙醇提取法提取的中草药,其抑菌、杀菌效果最好;采用微波水提取法与水煎煮法提取时,效果差别不大。中草药中所含有效成分的提取纯化即目标制剂所用原料的获得是整个中草药制剂中最重要、最关键的技术[21]。所有提取方法中大部分技术的基本原理是加热提取。研究显示,用传统煎煮法提取时,中草药的浸出效率仅为55.5%[22]。有关用微波萃取法提取中草药的有效成分是近期国内外学者研究的热点。如Jocelyn Pare等[23]创造性地提出了“细胞破壁理论”,认为细胞内部含水对微波能吸收较多,而周围非极性溶剂则吸收微波能较少,因而在细胞内部产生热应力,导致细胞破裂,因而强化了提取过程。Hao等[24]应用微波萃取技术从黄花蒿中提取青蒿素,结果既省时,提取率又高,经12 min微波可达到92.1%的提取率。Yang等[25]采用密闭式微波装置从人参中提取活性成分,证明微波辅助提取比索氏提取快60倍,比超声波提取快20倍。大量试验证明,微波技术在中草药有效成分的提取中具有很强的优势。本试验结果也证明,用微波提取法的效果比水煎煮法好,这为规模化生产中草药制剂并大面积用于养殖生产提供了很好的技术资料。

然而,在实际应用时,采用水煎煮法的成本最低,加热装置较容易获得;而采用微波提取时,民用微波炉成本较低,但容积小,不适合大剂量的提取,而用于工业生产的微波炉虽然容积很大,但成本高。因此,笔者认为,如果条件允许,大量的工业提取或者药厂制药可以采用微波提取的方法,而养殖户自己制备药物时可选用水煎煮法。

采用10种中草药对7株菌进行联合药敏试验,筛选出6组中草药复方,本课题组使用这些复方中草药对仿刺参“化皮病”进行室内预防、治疗以及对自然发病仿刺参的治疗试验,均显示出很好的预防和治疗效果(另文发表)。

另外,单味药物抗菌试验表明,五倍子、乌梅、石榴皮、黄芩、黄连对水产致病菌的抑制效果明显,可以作为细菌性疾病的防治药物,而甘草则适合作为五倍子、黄芩等的辅药配伍使用。

五倍子和乌梅两种中草药,在中医理论中均有敛肺降火、涩肠止泻、敛汗止血、收湿敛疮等功效。两种中草药配伍时,可能由不同的成分达到同样的抑菌作用,相互补充并产生协同作用。甘草性平,味甘,有解毒、祛痰、止痛、解痉以至抗癌等药理作用,在中医理论中甘草最重要的作用是调和诸药,缓解药物毒性、烈性。笔者认为,甘草分别与五倍子和黄芩配伍,增强了抑菌效果,其原因是在五倍子和黄芩本身抑菌效果较强的情况下,甘草对这两种药物的效果进行调和,起到协同的作用。黄芩的主要成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等,这些成分是五倍子中所没有的,将黄芩与五倍子配伍,可使抑菌效果增强。石榴皮中含量最多的成分为鞣质,其与乌梅配伍的原理和五倍子与乌梅配伍的原理可能相同。另外,石榴皮中含有蜡、树脂、甘露醇、糖、树胶、菊粉、黏质等五倍子所没有的成分,这些微量成分可能也存在一定的抑菌效果,一定程度上弥补了五倍子成分单一的空缺,可使其抑菌作用增强。中草药的配伍及其作用原理较复杂,对其抗菌成分以及各组分间相互作用的深入研究,将有助于弄清中草药的作用机制,从而进一步开发利用中草药。

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Antibacterial action of several Chinese herbal medicines to major marine pathogenic bacteria

LI Hua,LI Qiang,FU Lei
(Key Laboratory of Mariculture,Agriculture Ministry,PRC,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Abstract：The minimum inhibitory concentrations and minimum bactericidal concentrations of 10 kinds of Chinese herbal medicines including Fructus Psoraleae,Cortex Cinnamomi,Rhizoma Coptidis,Galla Chinensis,Pericarpium Granati,Radix et Rhizoma Rhei,Radix Scutellariae,Radix Sophorae Flavescentis,Fructus Mume and Radix Pulsatillae extracted by decoction by boiled water,microwave by ethanol and microwave by boiled water to 7 marine pathogenic bacteria strains were determined.Also,susceptibility of the pathogenic bacteria to the combination of Chinese herbal medicines was carried out to evaluate antibacterial action of several Chinese herbal medicines to marine major pathogenic bacteria.It was found that there were best bacteriostatic and bactericidal effect of Galla Chinensis and Pericarpium Granat,followed by Rhizoma Coptidis,Radix Scutellariae and Fructus Mume,and then Radix et Rhizoma Rhei,Fructus Psoraleae,Cortex Cinnamomi,Radix Sophorae Flavescentis and Radix Pulsatillae. The MIC was found to be 0.78-1.56 mg/mL(decoction or microwave by water)and 0.39-1.56 mg/mL(microwave by ethanol)for Galla Chinensis,1.56-3.13 mg/mL(decoction by water),0.78-1.56 mg/mL(microwave by ethanol)and 0.78-3.13 mg/mL(microwave by water)for Pericarpium Granati.MBC was 3.13-6.25 mg/mL (decoction by water)and 1.56-3.13 mg/mL(microwave by ethanol or water)for Galla Chinensis,6.25-25 mg/ mL(decoction by water),3.13-6.25 mg/mL(microwave by ethanol or water)for Pericarpium Granati.Chinese herbal medichines extracted with different methods showed differently antibacterial effect,being arranged as microwave by ethanol≥microwave by water≥decoction by water.There were synergistic inhibition of combination of Galla Chinensis and Fructus Mume,Galla Chinensis and Radix Glycytthizae for Vibrio splendidus,Radix Scutellariae and Radix Glycytthizae for Edwardsiellosis tarda,Pericarpium Granat and Fructus Mume for Streptococcus iniae, Galla Chinensis and Pericarpium Granati,Galla Chinensis and Radix Scutellariae for Shewanella marisflavi.

Key words：Chinese herbal medicine;bacteriostatic;bactericide;combined sensitivity test

基金项目：大连市科技攻关项目(2004B1NC030,2006B11NC109);海洋公益性行业科研专项(200905020);辽宁省海洋与渔业厅项目(201005)