摘要:为研究恩诺沙星对人工养殖中华草龟Chinemys reevesiis的药物毒性影响，在急性毒性试验中，将60只体质量约20 g的中华草龟随机分为6组，分别注射剂量为649.9、484.1、360.5、268.5、200.0、0(对照)mg/kg(体质量)的恩诺沙星，在慢性毒性试验中，将16只体质量约为100 g的中华草龟随机分为4组，分别注射剂量为0(对照)、10、30、50 mg/kg(体质量)的恩诺沙星，连续注射30 d，停药30 d，并在第0、2、13、28、40、50、60 d各抽取0.4 mL血液进行生化检测。结果表明:急性毒性试验中，观察两周后用Bliss法计算出半数致死浓度 (LD50)为434.45 mg/kg，对死亡龟进行组织学检查显示，龟肝组织的肝细胞索结构混乱，有较严重淤血，大量嗜酸性粒细胞浸润，胃肠壁有水肿；慢性毒性试验中，注射过程中高剂量组 (50 mg/kg)3只龟死亡，中剂量组 (30 mg/kg)1只龟死亡，龟血清谷草转氨酶 (AST)活性随时间呈先上升后下降的趋势，中剂量组显著高于低剂量组 (10 mg/kg)和对照组 (P＜0.05)，在停止注射后，中、高剂量组总胆红素 (T－bil)含量均迅速上升，剖检和组织学检查可见高剂量组肝脏密度减小，肝组织出现大小不一的空泡变性，肝小叶和肝细胞索无法辨识，肺组织结构混乱，胃肠道内有黄色黏稠液体，胃肠壁变薄、水肿，而肾组织无严重病变，注射部位肌肉出现较严重的水肿和炎症。研究表明，连续肌注恩诺沙星对中华草龟具有明显的肝毒性，且对肺、胃、肠道和肌肉组织也有一定的毒性，无肾毒性。
关键词:中华草龟；恩诺沙星；急性毒性；慢性毒性；血液毒理；组织毒理
中华草龟Chinemys reevesiis为濒危物种，在中国是非常受欢迎的养殖品种，不仅可以食用、药用，而且当做宠物已有悠久历史。然而，人工养殖常导致龟类疾病频发，且多数为细菌性疾病，如肺炎[1]、眼病[2]、甲壳皮肤溃疡[3]等。目前，抗生素是治疗龟类细菌性疾病的首选药物，但抗生素容易引发药源性疾病的产生。使用抗生素对养殖龟鳖疾病的治疗用药量仍不明确，效果也不显著，制约了产业的发展，因此，针对龟鳖个体的临床医学技术研究十分迫切。
目前，在龟类临床药物研究中，头孢他啶[4]、阿米卡星[5]、恩诺沙星[6－8]、马波沙星[9]、泰拉霉素[10]等均有报道，但对于其中的药物毒副作用研究屈指可数。对使用伊维菌素死亡的红腿陆龟Geochelone carbonaria进行组织病理学检查发现，伊维菌素会导致其肝脏脂肪变性[11]；口服土霉素和诺氟沙星易引发中华鳖Trionyx sinensis肝脏损坏，导致药源性肝病[12]；连续口服芬苯达唑剂的赫曼陆龟Testudo hermanni会出现短暂的低血糖、高尿酸血症、高磷血症和高血球蛋白[13]。这些研究为龟鳖药物毒性的研究提供了基本资料。恩诺沙星对陆生动物和水产动物的许多致病菌均有较好的抑菌效果，已被广泛用于各类动物的疾病预防和治疗中，也是爬行动物的常用药物。对恩诺沙星在龟类体内药代动力学的研究为临床上提供了用法用量:口服10 mg/kg[6]、肌肉注射5 mg/kg[6－7]、腹腔注射10 mg/kg[8]，但到目前为止，未见有对其相关毒性毒理的研究报道，这与大型动物相比较为滞后。恩诺沙星对家禽及哺乳动物等的毒性已有报道，并被认为是相对安全的药物[14－16]，但对龟鳖等两栖爬行动物是否安全还未知。本研究中，进行了恩诺沙星对养殖中华草龟的急性毒性和慢性毒性试验，旨在为人工养殖龟鳖临床用药提供参考。
急性毒性试验用60只3月龄人工养殖中华草龟，体质量为20 g左右，慢性毒性试验用16只人工养殖中华草龟，体质量为100 g左右，均为雄性，同批购于江苏省苏州市某养殖场。由于龟类无明确的健康指标参考，因此，本研究中以吃食好、活力强、无明显外伤、无异常行为、无明显临床症状的视为正常个体，用作试验动物。
试验器材和试剂主要包括:全自动血液生化分析仪BS－200，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；拜有利 (5%恩诺沙星注射液)，四川动物保健有限公司；血生化试剂盒，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；H.E.染色试剂。
试验前，所有中华草龟驯养2～3周，使其适应试验条件。采血前停食1 d，养殖水温保持在25℃左右。
1.2.1 急性毒性试验 将试验用中华草龟随机分为6组，每组10只，根据预试验结果设定，对每组龟逐个从后腿基部肌肉注射不同剂量的恩诺沙星注射液，6组注射剂量分别为 649.9、484.1、360.5、268.5、200.0 mg/kg(体质量)，对照组注射同体积的生理盐水，每次每只龟注射容积控制在0.3 mL，注射后分别在30 min、1 h、4 h持续观察其行为变化，并在注射后14 d内持续观察其中毒反应。统计14 d内每组龟的死亡总数[17－19]，用Bliss法计算得出半数致死剂量 (LD50)[19－20]。急性毒性试验期间，将死亡龟立刻进行解剖，同时随机取对照组3只解剖，将各内脏器官组织于福尔马林试剂中保存，制作组织毒理切片，用H.E.染色，镜检、拍照。
1.2.2 慢性毒性试验 将中华草龟随机分为4组，每组4只 (编号为1～4号)，对照组每天注射0.25 mL生理盐水，低、中、高剂量组根据临床使用量和急性毒性试验结果注射恩诺沙星剂量分别为10、30、50 mg/kg(体质量)，每次每只龟注射容积控制在0.25 mL。每天16:00～17:00注射，连续注射30 d，后停药30 d，并观察其食量、行为变化。
血生化指标检测:分别于注射后第0、2、13、28、40、50、60 d的9:00～10:00时抽取每只龟0.4 mL(不超过体质量的1%)血样于含肝素锂血生化管中，以4000 r/min离心15 min，取血浆并于4℃下保存，24 h内检测其总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、血糖、尿素氮、尿酸、肌酐含量。
组织毒理学检查:对50 mg/kg剂量组试验期间死亡的龟及时进行解剖；在试验结束时，随机选取对照组、10 mg/kg组、30 mg/kg组各两只龟剖检。将各内脏器官组织于福尔马林试剂中保存，制作组织毒理切片，用H.E.染色，镜检、拍照。
试验数据用SPSS 19.0软件进行处理，用Duncan法进行多重比较，显著性水平设为0.05。
2.1.1 注射后14 d内中华草龟行为及食欲观察
649.9 mg/kg剂量组:注射后15 min，有半数龟出现躁动、伸长脖子呼吸、呕吐现象，30 min时均四肢张开、缩头、不动；1 h时已有3只龟出现四肢无力，头部下垂，呈濒死状态，2只龟出现口吐黏液现象，4只龟前后肢扭曲僵硬；24 h时有7只龟死亡；48 h时有9只龟死亡。
484.1 mg/kg剂量组:注射后30 min，龟开始躁动不安，2只龟出现呕吐；1 h时有4只龟出现呼吸困难，2只龟四肢无力、头部扭曲；24 h时有5只龟死亡；48 h时有8只龟死亡。
360.5 mg/kg剂量组:注射后1 h，有3只龟出现呕吐，其中1只伸头张嘴呼吸；4 h时1只龟后肢僵直，2只头部抽动；24 h时1只龟四肢无力；48 h时有2只龟死亡，其余均存活，但均不吃食。
268.5 、200.0 mg/kg剂量组:注射后1 h，龟出现少量呕吐，但并无明显不良表现；5 d时龟活动较弱，仅少量吃食；7 d时大多数龟恢复食欲。
对照组龟每日吃食良好，较活跃。
2.1.2 半致死剂量 (LD50) LD50结果见表1，并建立以下方程:
回归方程 Y＝－20.908＋9.8213 lg D，
50%致死剂量 LD50＝434.45 mg/kg，
LD50(Feiller校正)95%的可信限为378.7～500.82 mg/kg，
5%致死剂量LD5＝295.43 mg/kg，
表1 注射恩诺沙星对中华草龟急性毒性试验
Tab.1 Acute toxicity test of enrofloxacin injection to Chinese pond turtle Chinemys reevesiis
剂量(D)/(mg·kg－1)dose回归机率单位(Y)return probability unit 649.9 2.8128 10 9 90.00 6.2817 6.7178 484.1 2.6849 10 8 80.00 5.8415 5.4616 360.5 2.5569 10 2 20.00 4.1585 4.2042 268.52.42891000.00—2.9474 200.02.30101000.00—1.6911剂量对数(lg D)logarithmic dose动物数量/ind.number死亡数量/ind.dead number死亡率/%percent mortality试验机率单位(yem)probability unit
95%致死剂量LD95＝638.88 mg/kg。
2.1.3 急性毒性试验中龟组织毒理学结果 临床解剖结果显示，注射高浓度 (649.9 mg/kg)恩诺沙星的组龟肝脏体积增大，有严重淤血，胃肠壁红肿，布满血丝 (图1)。
组织毒理学检验发现:注射高浓度 (649.9 mg/kg)恩诺沙星的组龟肝组织的肝索结构混乱，细胞核、细胞质体积增大，并有部分细胞破裂，淤血严重，嗜酸性粒细胞浸润；胃肠壁组织有明显水肿；其他组织未见明显病变 (图2)。
图1 恩诺沙星急性毒性试验中华草龟解剖学结果
Fig.1 Anatomy of Chinese pond turtle Chinemys reevesiis in acute toxicity of enrofloxacin
注:A，高剂量组 (649.9 mg/kg)龟肝脏大量瘀血 (⇧)；B，高剂量组龟胃肠壁红肿，有血丝 (⇧)；C，对照组龟的肝和胃肠
Note:A， extravasated blood in liver of the turtle in high dose group(649.9 mg/kg)(⇧)； B， bloodshot， red and swollen gastrointestinal wall in the turtle in high dose group(649.9 mg/kg)(⇧)； C， liver， stomach and intestine of the turtle in control group
图2 恩诺沙星急性毒性试验中华草龟组织毒理学结果
Fig.2 Histotoxicology of Chinese pond turtle Chinemys reevesiis in acute toxicity of enrofloxacin
注:A，高剂量组 (649.9 mg/kg)龟肝组织的肝索结构混乱，大量瘀血，组织间隙嗜酸性粒细胞浸润 (⇧)，肝细胞的细胞核、细胞质扩张、破裂 (⬆)(200×，小图1000×)；B，高剂量组龟胃有明显水肿 (▲) (100×)；C，高剂量组龟肠有明显水肿 (▲) (100×)；D，对照组肝脏组织，轻微淤血，肝索结构完整 (200×)；E，对照组龟胃 (100×)；F，对照组龟肠 (100×)
Note:A， disorder architecture of hepatic cord，extravasated blood in liver，organization clearance eosinophil infiltration(⇧)， liver nucleus and cytoplasm expansion， and rupture(⬆)in the turtle in high dose group(649.9 mg/kg)(200×， insert 1000×)； B， stomach edema in the turtle in high dose group(649.9 mg/kg)(▲)(100×)； C， intestine edema in the turtle in high dose group(▲)(100×)； D， structurally complete liver with mild congestion in the control group(200×)； E， stomach in the turtle in control group(100×)； F， intestine in the turtle in control group(100×)
2.2.1 中华草龟吃食和行为变化 第1天注射恩诺沙星后30 min，除对照组外，10、30、50 mg/kg剂量组龟均出现呕吐现象，之后未有呕吐行为。
对照组:基本保持吃食良好，反应灵活，力气大。
10 mg/kg剂量组:注射后，龟食欲均较好，10 d时龟陆续吃食减少、进食缓慢，22 d时少数不食，停止注射后龟逐渐恢复食欲但食量较少。注射过程中少数龟喜躲避，行动不灵活，多数龟活跃、力气大。
30 mg/kg剂量组:注射后，龟食欲均较好，3 d时陆续停食，停止注射后龟食欲依然未有改善。注射后10 d时龟活力差，力气小，胆小，常躲藏在阴暗处，18 d时4号样品龟在水中倒翻并死亡。
50 mg/kg剂量组:注射后，龟食欲均较好，3 d时龟停食。注射后1 d时龟活力开始变差，力气小，16 d时4号样品龟在水中倒翻并死亡，之后其中的两只龟陆续死亡。
2.2.2 血生化检测结果 由于50 mg/kg组仅剩1只中华草龟，因此，只对对照组、10、30 mg/kg 3组龟的血液生化指标用SPSS 19.0软件进行统计分析，共检测了10个指标，结果表明，谷草转氨酶(AST)活性和总胆红素 (T－bil)含量均与注射剂量、注射时间有显著的相关性。
血清AST活性随着注射剂量的增大呈显著升高，从第13天开始，一直保持30 mg/kg组显著高于10 mg/kg组且二者均显著高于对照组的情况(P＜0.05)，连续注射过程中，每组AST活性均呈先上升后下降的趋势，50 mg/kg组仅剩的1只龟AST变化趋势与30 mg/kg组相似。停止注射后，10 mg/kg组AST活性恢复到初始水平，而30、50 mg/kg组依然保持较高水平 (图3)。
总胆红素 (T－bil)在连续30 d注射过程中4组并未有明显差异 (P＞0.05)，但在停止注射后10、30、50 mg/kg组开始出现一段时间迅速升高(图4)。统计结果表明:第 50、60天时，30 mg/kg组T－bil含量显著高于10 mg/kg组和对照组(P＜0.05)，10 mg/kg组第50天时显著高于对照组(P＜0.05)，第60天时恢复至初始水平。
2.2.3 临床解剖结果 50、30 mg/kg组中华草龟肝脏密度小，在福尔马林固定液中呈漂浮状态，而10 mg/kg和对照组肝脏密度较大，在福尔马林固定液中下沉；50 mg/kg组胃内充满黄色黏稠液体，而10、30 mg/kg组和对照组胃内未有黏稠液体；50、30 mg/kg组注射部位明显肿起，肌肉部分坏死、颜色发黑，而10 mg/kg组和对照组未见肿起，肌肉颜色红润。
图3 注射不同剂量恩诺沙星时中华草龟血清AST活性的变化
Fig.3 Changes in serum AST activity in Chinese pond turtle Chinemys reevesiis injected with different doses of enrofloxacin
图4 注射不同剂量恩诺沙星时中华草龟血清T－bil的变化
Fig.4 Changes in serum T－bil level in Chinese pond turtle Chinemys reevesiis injected with different doses of enrofloxacin
2.2.4 组织毒理学结果
肝脏:50 mg/kg组死亡的3只中华草龟肝脏均出现大小不一的空泡变性，肝细胞坏死，肝小叶和肝索结构已分辨不出；30、10 mg/kg组肝脏也出现较严重的空泡变性并有淤血，细胞坏死，但肝索结构仍存在；对照组肝脏也有一定的空泡变性，但肝小叶和肝索结构完整 (图5)。
肺:50 mg/kg组肺脏严重缺血，并有不同程度的组织结构混乱，部分细胞破裂、坏死，而对照组肺脏结构完整，血细胞充盈 (图5)。
胃肠:50 mg/kg组4只龟胃的病变并不完全一致，1只出现水肿，1只则为固有膜混乱，胃壁均明显变薄；30 mg/kg组胃亦有轻微水肿；而对照组胃则结构完整未有明显病变。50 mg/kg组肠壁明显变薄，水肿，肠绒毛结构不完整，而对照组和10、30 mg/kg组均未见有明显病变 (图6)。
图5 恩诺沙星慢性毒性试验中华草龟肝脏和肺组织毒理学结果
Fig.5 Histotoxicology of liver and lung in Chinese pond turtle Chincmys reevesiis in acute toxicity test of enrofloxacin
注:A～C，高剂量组 (50 mg/kg)龟肝脏组织，细胞坏死界限不清、大小空泡 (⬆)，中央静脉界限不清、缺血 (▲)(200×)；D～F，高剂量组 (50 mg/kg)龟肺组织细胞坏死、结构混乱 (▲)(200×)；G，对照组龟肝组织 (200×)；H，对照组龟肺组织 (200×)
Note:A－C，liver of Chinese pond turtle in high dose group(50 mg/kg)， showing cell necrosis with unclear boundary and degeneration of vacuoles(⬆)， unclear and ischemia in central venous line(▲)(200×)； D－F，lung of Chinese pond turtle in high dose group(50 mg/kg)，showing cell necrosis and disorder of structure(▲)(200×)； G， liver of the turtle(200×)in control group； H， lung of the turtle(200×)in control group
图6 恩诺沙星慢性毒性试验中华草龟胃肠、肾脏和肌肉组织毒理学结果
Fig.6 Histotoxicology of stomach， intestines， kidney and muscle of Chinses pond turtle Chincmys reevesiis in acute toxicity of enrofloxacin
注:A、B，高剂量组 (50 mg/kg)龟胃壁变薄，固有膜混乱 (▲)，水肿 (⬆)(100×，小图400×)；C，对照组龟胃 (100×)；D、E，高剂量组龟肠壁变薄，肠绒毛结构不完整 (⬆)(100×)；F，对照组龟肠 (100×)；G、H，高剂量组龟肾小球完整 (⇧)，部分肾小管颗粒变性 (⬆)(200×)；I，对照组肾部分肾小管颗粒变性(⬆)(200×)；J，高剂量组肌肉组织，肌纤维间隙增大，水肿(▲)(200×)；K，中剂量组 (30 mg/kg)龟肌肉组织，水肿，嗜酸性粒细胞浸润 (⬆)(200×，小图1000×)；L，对照组龟肌肉组织 (200×)
Note:A－B， stomsch of Chinese pond turtle in high dose group(50 mg/kg)，showing thin stomach wall， disorder of lamina propria(▲)and edema(⬆)(100×， insert 400×)； C， stomach of Chinses pond turtle in control group(100×)； D－E， intestines of the turtle in high dose group，showing thin intestinal wall， uncomplete structure of intestinal villus(⬆)(100×)； F， intestines of Chinses pond turtle in control group(100×)；G－H，kidney of Chinses pond turtle in high dose group， showing glomerular complete(⇧)，part of the renal tubular particle degeneration(⬆)(200×)； I， kidney of Chinses pond turtle in control group， showing part of the renal tubular particle degeneration(⬆) (200×)； J， muscle of Chinses pond turtle in high dose group，showing muscle fiber gap and edema(▲)(200×)； K， muscle of Chinses pond turtle in middle dose group(30 mg/kg)， showing edema， and eosinophil infiltration(⬆)(200×， insert 1000×)； L， muscle of Chinses pond turtle in control group(200×)
注射部位肌肉组织:50 mg/kg组注射部位严重水肿、变性，30 mg/kg组有大量红细胞和嗜酸性粒细胞浸润，而对照组肌纤维清晰，结构正常(图6)。
肾脏:50 mg/kg组肾小球结构基本完整，部分肾小管出现颗粒变性、浑浊，细胞界限不清，主要结构完整，30、10 mg/kg组与50 mg/kg组结果基本一致，对照组肾小管颗粒变性比50 mg/kg组更加严重，主要结构完整 (图6)。
目前，中国养殖龟鳖群体给药方法主要与鱼类相似，一般为浸泡、泼洒或拌饲，但这些方式在龟鳖治疗中有较大的局限性。浸泡和泼洒用药多，且药量不明确，基本只能起到预防作用，拌饲也只能针对病情较轻、吃食较好的个体，而多数龟类患病时食欲下降甚至停食而无法得到治疗。个体给药方式为强制口服和肌肉注射，注射治疗既能有效控制药量也便于操作。因此，本试验中选择注射方式给药，也为龟鳖临床治疗提供了可行性方法。
恩诺沙星是常用的兽药，但目前对其毒性研究较少，且在爬行动物中还未见有相关报道。恩诺沙星对小鼠的口服LD50为3579 mg/kg，腹腔注射LD50为571.3 mg/kg，为低毒性[16]；对异育银鲫Carassius auratus gibelio[21]、 鲟 Acipenser sp.[22]的口服LD50分别为 1949.84、1590.36 mg/kg， 也为低毒性。但从口服毒性看，哺乳动物与水生动物有较大差异，反映出恩诺沙星的毒性可能与物种有关。本试验中，肌注恩诺沙星对中华草龟的 LD50为434.45 mg/kg，参考联合国世界卫生组织推荐外来化合物急毒性分级标准，恩诺沙星对中华草龟的毒性为中毒。表明恩诺沙星可能对爬行动物的毒性较大。
组织毒理学结果表明，恩诺沙星急性中毒会使中华草龟肝脏严重损伤，同时对胃肠道也有一定刺激。注射后多数个体出现四肢僵硬、头部抽搐等行为，并在短时间内死亡，推断恩诺沙星对中华草龟神经系统有影响，且这很可能是导致中华草龟急性中毒死亡的主要原因，但还需进一步研究证实。
恩诺沙星的肝毒性对许多生物均存在，异育银鲫连续30 d口服40 mg/kg剂量的恩诺沙星会导致其血清AST、ALT、总蛋白等含量升高，表明按40 mg/kg长期口服会导致异育银鲫肝损伤[21]；体外培养的鸡肝细胞的存活率随着恩诺沙星浓度的增加而降低，当恩诺沙星浓度达到80 μg/mL时，肝细胞出现破裂坏死，上清液中AST活性也随之增高[23]。本试验结果也表明，恩诺沙星对中华草龟有肝毒性，随注射剂量的增加，中华草龟肝细胞破裂坏死，导致细胞内酶释放[24]，从而引起血清AST、T－bil含量升高。同时，通过连续抽血发现，4组龟血清AST活性随时间均呈现先上升后下降的趋势。相关研究指出，沙漠地鼠陆龟 Gopherus agassizii血清 AST上升与肝脏和肌肉损伤均有关[25－26]。由此推断，本试验中肌注恩诺沙星前期，4组血清AST活性上升趋势较为一致，这可能与注射造成其肌肉损伤有关，注射一段时间后试验组与对照组相比血清AST活性显著升高表明，试验组既有肌肉损伤也有肝损伤，而后期肌肉损伤停止，因此，血清AST活性有所下降，但中、高剂量组停药后30 d时血清AST活性依然较高，说明注射量达到30 mg/kg以上时引起的肝损伤不可逆。
目前，对爬行动物的组织毒理学研究鲜有报道。本试验中对注射后死亡的龟进行组织学检查，相较血生化检测，能够更直观地反映出恩诺沙星对中华草龟各器官毒性情况。有相关研究将中华鳖药源性肝病在组织学上分成5个阶段，第5阶段肝组织接近硬化坏死、血细胞坏死和血浆变性[12]。本试验中，高剂量组肝脏组织，已缺血、空泡变形，甚至中央静脉、肝小叶等基本结构无法辨识，肝脏功能几乎丧失，这表明恩诺沙星对中华草龟具有较强的慢性肝毒性，长期使用可能会造成药源性肝病。而肺组织病变仅在高剂量组死亡的龟中较严重，推断肺损伤可能为其慢性中毒后虚弱溺水所致。此外，口服恩诺沙星对中华草龟胃肠有刺激，会引起龟类呕吐[6]，本试验中发现，注射后中华草龟呕吐、胃肠水肿，证明注射恩诺沙星亦会对其胃肠有刺激。而注射组肾脏组织结构优于对照组，说明恩诺沙星对中华草龟不仅无肾毒性，而且起到一定的治疗效果。
急性和慢性毒性试验结果均显示，恩诺沙星对中华草龟有较强肝毒性，这和中华鳖药源性肝病结果一致[12]，且对胃肠道有一定刺激，但存在一定的差异。急性毒性试验肝脏组织有较严重淤血、炎性细胞浸润、细胞破裂坏死、无空泡变性，慢性毒性试验肝脏组织则缺血、有严重的空泡变性；急性毒性试验胃肠组织水肿但肠绒毛完整，而慢性毒性试验除水肿外还出现肠壁变薄、肠绒毛结构不完整现象。
龟类疾病的治疗具有疗程长的特点，长期用药较容易造成慢性中毒，甚至药源性疾病，根据本试验结果，对人工养殖中华草龟长期注射10 mg/kg便可能造成一定程度的肝损伤，再结合已有的肌注恩诺沙星对几种龟的药代动力学研究[6－7]，推断恩诺沙星在临床中的注射剂量应为5～10 mg/kg，可供人工养殖水龟、半水龟类治疗参考。
本试验中还发现，注射前人工养殖中华草龟血清 AST、 T－bil与野生陆龟[25－26]、 黄喉拟水龟[27]、海龟[28－29]相比处于较高水平，且对照组肝脏组织也有病变，这可能与人工养殖水龟的长期温室养殖环境和饲料种类有关[30]，也可能是养殖龟鳖的普遍性问题。因此，在用恩诺沙星治疗人工养殖水龟疾病前应对其进行肝功能检查，若发现已有肝损伤，则应适当减少用量或选用替代药物。此外，大量注射会导致其肌肉损伤，因此，使用恩诺沙星肌肉注射时应尽量避免长期在同一位置注射。
参考文献:
[1] 陶锦华，李康然，韦平.石龟肺炎克雷伯氏菌感染的诊断与防治[J].广西畜牧兽医，2002，18(6):20－21.
[2] 陈晨，潘连德.宠物龟眼炎的病原鉴定及临床药物治疗的研究[J].上海海洋大学学报，2011，20(2):244－251.
[3] 王凯，刘译浓，冯万能，等.宠物龟甲壳溃疡的临床诊治[J].水产科技情报，2014，41(1):35－38.
[4] Stamper M A，Papich M G，Lewbart G A，et al.Pharmacokinetics of ceftazidime in loggerhead sea turtles(Caretta caretta)after single intravenous and intramuscular injections[J].Journal of Zoo and Wildlife Medicine，1999，30(1):32－35.
[5] Caligiuri R，Kollias G V，Jacobson E，et al.The effects of ambient temperature on amikacin pharmacokinetics in gopher tortoises[J].Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics， 1990， 13(3):287－291.
[6] James S B，Calle P P，Raphael B L，et al.Comparison of injectable versus oral enrofloxacin pharmacokinetics in red－eared slider turtles，Trachemys scripta elegans[J].Journal of Herpetological Medicine and Surgery，2003，13:5－10.
[7] Prezant R M，Isaza R，Jacobson E R.Plasma concentrations and disposition kinetics of enrofloxacin in gopher tortoises(Gopherus polyphemus)[J].Journal of Zoo and Wildlife Medicine，1994，25(1):82－87.
[8] Giorgi M，Capasso M，Briganti A，et al.Blood concentrations of enrofloxacin and the metabolite ciprofloxacin in yellow－bellied slider turtles(Trachemys scripta scripta)after a single intracoelomic injection of enrofloxacin[J].Journal of Exotic Pet Medicine，2013，22(2):192－199.
[9] Mader D R.Reptile Medicine and Surgery[M].2nd ed.St.Louis:Saunders/Elsevier Inc，2006:644－657.
[10] Kinney M E，Lamberski N，Wack R，et al.Population pharmacokinetics of a single intramuscular administration of tulathromycin in adult desert tortoises(Gopherus agassizii)[J].Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2014，37(5):500－507.
[11] Teare J A，Bush M.Toxicity and efficacy of ivermectin in chelonians[J].Journal of the American Veterinary Medical Association，1983，183(11):1195－1197.
[12] 陈彦伶，牟群，潘连德，等.中华鳖药源性肝病模型的构建及其病理学观察[J].大连海洋大学学报，2013，28(1):61－66.
[13] Neiffer D L，Lydick D，Burks K，et al.Hematologic and plasma biochemical changes associated with fenbendazole administration in Hermann’s tortoises(Testudo hermanni)[J].Journal of Zoo and Wildlife Medicine，2005，36(4):661－672.
[14] 李继昌，张秀英，丛霞，等.恩诺沙星对雏鸡的急性毒性和蓄积毒性研究[J].黑龙江畜牧兽医，2000(8):20.
[15] 叶启薇，孙永学.恩诺沙星对SD系大白鼠的急性及亚急性毒性研究[J].华南农业大学学报，1995，16(4):1－4.
[16] 唐一鸣，姜中其，陈俭.乳酸恩诺沙星对小鼠的急性毒性试验[J].中国兽药杂志，2010，44(4):29－30，60.
[17] 林丽萍，杜芳琼，莫杰明，等.氨糖胶囊的急性和亚急性毒理学评价[J].食品研究与开发，2015，36(14):136－138.
[18] 童文，杨晓，胡尚钦，等.变异白色红花总黄酮提取物安全性毒理学评价[J].天然产物研究与开发，2016，28(2):202－209.
[19] 张云美，潘永全，韩志刚，等.三黄合剂的毒理学研究[J].中国药房，2008，19(12):891－893.
[20] 顾兵，张政，李玉萍，等.半数致死量及其计算方法概述[J].中国职业医学，2009，36(6):507－508，511.
[21] 赵蕾，曹海鹏，陈辉，等.恩诺沙星对银鲫急性毒性及血液生化指标的影响[J].动物学杂志，2013，48(3):446－450.
[22] 郭娇娇，杨虎，潘红艳，等.恩诺沙星对鲟鱼的急性毒性研究[J].现代农业科技，2010(20):311－315.
[23] 刘腾飞，郭凡溪，耿智霞，等.恩诺沙星联合内毒素致鸡原代肝细胞损伤模型的建立[C]//2013年中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十二次学术讨论会论文集.郑州:中国畜牧兽医学会，2013:165.
[24] 王子锡.肝胆疾病患者血清肝酶谱变化及分析[J].现代中西医结合杂志，2011，20(24):3044－3045.
[25] Christopher M M.Physical and biochemical abnormalities associated with prolonged entrapment in a desert tortoise[J].Journal of Wildlife Diseases，1999，35(2):361－366.
[26] Dickinson V M，Jarchow J L，Trueblood M H.Hematology and plasma biochemistry reference range values for free－ranging desert tortoises in Arizona[J].Journal of Wildlife Diseases，2002，38(1):143－153.
[27] Yu P H，Yang P Y，Chiu Y S，et al.Hematologic and plasma biochemical reference values of the yellow pond turtle Mauremys mutica and the effects of sex and season[J].Zoological Studies，2013，52(1):24.
[28] Flint M，Morton J M，Limpus C J，et al.Development and application of biochemical and haematological reference intervals to identify unhealthy green sea turtles(Chelonia mydas)[J].The Veterinary Journal，2010，185(3):299－304.
[29] Anderson E T，Minter L J，Clarke E O，et al.The effects of feeding on hematological and plasma biochemical profiles in green(Chelonia mydas)and Kemp’s Ridley(Lepidochelys kempii)sea turtles[J].Veterinary Medicine International，2011:1－7.doi:10.4061/2011/890829.
[30] 潘连德，孙玉华，刘其根.温室养殖中华鳖非寄生性肝病的诊断[J].水产科技情报，1999，26(1):10－15.
Acute and chronic toxicological effects of continuous intramuscular injection of enrofloxacin on Chinese pond turtle
Abstract:Both acute and chronic toxic tests were conducted to evaluate the effects of continuous intramuscular injection of enrofloxacin on Chinese pond turtle Chinemys reevesiis.In the acute test， 60 individuals of 3－month－old Chinese pond turtle weighing around 20 g were randomly divided into 6 groups and injected with enrofloxacin at a dose of 649.9， 484.1， 360.5， 268.5， 200.0 mg/kg and 0(as control group).In the chronic test， 16 individuals of Chinese pond turtle with body weight of 100 g were randomly divided into 4 groups and injected with enrofloxacin at a dose of 0(as control group)， 10， 30， and 50 mg/kg for successive 30 days and for 30 days withdrawal.Blood samples of 0.4 mL were taken for blood biochemical tests 0， 2， 13， 28， 40， 50， and 60 days after administration.In two week acute test，the LD50was estimated to be 434.45 mg/kg by the method of Bliss.The histopathological examination of the dead turtle in the highest dose group showed that the hepatic cell cords were disordered，severe congestion， massive eosinophil infiltration and edema in gastrointestinal wall.In the chronic toxic test， 3 turtles were all found to be dead in the maximal dose group and 1 turtle dead in 30 mg/kg dose group.Blood biochemical analysis revealed that activity of serum aspartate aminotransferase(AST)was first increased and then decrease，significantly higher in 10 mg/kg group than in the control group(p＜0.05).Total bilirubin(T－bil)levels were elevated rapidly at injection stopping time in the medium and high dose groups.The autopsy showed that the liver density was decreased and suspended in the formalin in the middle and high dose groups，and that the yellow viscous liquid was found in the gastrointestinal tract in the high－dose group.The toxicological analysis in tissues demonstrated that continuous injection of high－dose enrofloxacin led to severe hepatic lesions in the liver of Chinese pond turtle， including vacuolar degeneration， and unidentified hepatic lobules and hepatocellular cords.The disorders of lung， thin wall and edema of the gastrointestinal tract were observed， without severe disorder in the renal tissue.Relatively severe edema and inflammation came out around the muscle injected.In conclusion，there is an obvious hepatotoxic effect of enrofloxacin， to some extend， toxicity in lung， and gastrointestinal tissue in area of injection，and no toxicity in the kidneys of Chinese pond turtle.
Key words:Chincmys reevesii； enrofloxacin； acute toxicity； chronic toxicity； hematotoxicology； tissue toxicology
中图分类号:Q954.4
文献标志码:A
DOI:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.06.002
文章编号:2095－1388(2017)06－0643－08
收稿日期:2017－03－28
基金项目:水产动物遗传育种上海市协同创新中心 (ZF1206)